На месте Гибридизация у личинок и молоди рыбок данио во время развития мезонефроса
Summary
Рыбка данио является важной моделью для понимания развития почек. Здесь протокол гибридизации in situ оптимизирован для обнаружения экспрессии генов у личинок рыбок данио и молоди во время развития мезонефроса.
Abstract
Рыбка данио образует две почечные структуры за свою жизнь. Пронефрос (эмбриональная почка) образуется во время эмбрионального развития и начинает функционировать через 2 дня после оплодотворения. Состоящий только из двух нефронов, пронефрос служит единственной почкой во время личиночной жизни, пока не потребуется больше функции почек из-за увеличения массы тела. Чтобы справиться с этой более высокой потребностью, мезонефрос (взрослая почка) начинает формироваться во время метаморфоза. Новые первичные нефроны сливаются с пронефрами и образуют соединенные просветы. Затем вторичные нефроны сливаются с первичными (и так далее), чтобы создать разветвленную сеть в мезонефросе. Подавляющее большинство исследований сосредоточено на пронефросах из-за простоты использования эмбрионов. Таким образом, необходимо разработать методы изучения более старых и крупных личинок и молоди рыб, чтобы лучше понять развитие мезонефроса. Здесь протокол гибридизации in situ для анализа экспрессии генов оптимизирован для проникновения зонда, промывки зондов и антител, а также отбеливания пигментов для лучшей визуализации мезонефроса. Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) используется для маркировки клеток-предшественников и дистальных канальцев зарождающихся нефронов. Этот протокол заполняет пробел в исследованиях мезонефроса. Это важная модель для понимания того, как новые ткани почек формируются и интегрируются с существующими нефронами и дают представление о регенеративной терапии.
Introduction
Эмбрион рыбки данио является важной моделью для изучения развития тканей из-за его небольшого размера, прозрачности, доступных инструментов и выживаемости без кормления в течение пяти дней1,2. Это в значительной степени способствовало пониманию развития почек и сохранения между рыбками данио и млекопитающими3,4,5. Почки играют важную роль в поддержании гомеостаза жидкости, фильтрации крови и выведении отходов6. Нефрон, функциональная единица почки, содержит фильтр крови, соединенный с длинным канальцем. У рыбок данио две почечные структуры формируются на протяжении всей ее жизни. Пронефрос (временная эмбриональная почка) образуется сначала во время раннего развития. Он состоит из двух нефронов, проходящих вдоль передне-задней оси и становится функциональным примерно через 2 дня после оплодотворения (dpf). Полезность пронефроса заключается в его простоте, имея всего два нефрона, которые в основном линейны и легко визуализируются (хотя проксимальный извитый каналец начинает сворачиваться при трех dpf)3. Это облегчило не только изучение его раннего развития из промежуточной мезодермы, но и структуру сегментации и ремонт канальцев7,8.
Полезность рыбок данио становится ограниченной после пяти dpf, когда желток уменьшается и личинки полагаются на питание в водной системе9. Примерно в возрасте 2 недель личинки претерпевают метаморфозы в молодых особей, где образуются новые ткани, а старые ткани теряются и/или реорганизуются9. Это также когда образуется мезонефрос (постоянная взрослая почка) 10,11,12. Первый взрослый нефрон образуется около шестого сомита и сливается с дистальным ранним канальцем пронефроса. Дополнительные нефроны добавляются сзади к этому положению изначально, но также и к передней части позже. Первичные нефроны в этой первой волне сливаются с канальцами пронефроса и имеют общий просвет для осаждения своих отходов. Вторичные нефроны образуются в следующей волне и сливаются с первичными нефронами. Этот повторяющийся процесс создает мезонефрос, который разветвлен, несколько сродни почке млекопитающих. Предположительно, пронефрос в конечном итоге теряет свою трубчатую идентичность и становится двумя основными собирательными протоками, где все нефроны сливают свои отходы13.
До образования первого взрослого нефрона одиночные клетки-предшественники начинают появляться в ~4 мм (общая длина) личинок (~10 dpf). Эти клетки, которые отмечены в трансгенной линии Tg(lhx1a-EGFP), прилипают к пронефросу и, по-видимому, мигрируют в будущие места нефрогенеза. Отдельные клетки объединяются в кластеры, которые дифференцируются в новые нефроны12. Неясно, где находятся эти клетки или какие гены они экспрессируют до начала мезонефрогенеза.
Понимание развития мезонефроса дает представление о почках млекопитающих так, как пронефрос не может. К ним относятся образование нефрогенных агрегатов из одиночных клеток-предшественников, функциональная интеграция новых нефронов с существующими и ветвящийся морфогенез. Тем не менее, существуют ограничения для изучения постэмбрионального развития. Личинки менее прозрачны из-за их большего размера и пигментации. Временная шкала развития не является синхронной среди отдельных животных и сильно зависит от факторов окружающей среды, таких как кормление и скученность9,14. Хотя нокдаун-реагенты существуют, они менее эффективны в личинках по сравнению с эмбрионами15. В этом протоколе описан метод гибридизации in situ для определения экспрессии генов во время развития мезонефроса рыбок данио. Несколько шагов оптимизированы для увеличения визуализации мезонефроса и проникновения и промывки зонда и антитела. Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) используется вместе с зондом для EGFP для маркировки одиночных клеток-предшественников, нефрогенных агрегатов и дистальных канальцев зарождающихся нефронов. Этот метод обеспечит более глубокое понимание развития мезонефроса и понимание регенеративной терапии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь метод гибридизации in situ направлен на изучение развития мезонефроса. Однако его можно применять для изучения развития других тканей и органов во время метаморфоз, таких как кишечник, нервная система, чешуя и пигментация14. Зонды могут быть сгенерированы…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование было предоставлено Академией наук Пенсильвании и Содружеством биологов Пенсильвании, а также Университетом Индианы в Пенсильвании (Школа аспирантуры и исследований, Департамент биологии и Фонд биологии синтии Сушак для передового опыта). Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) была предоставлена доктором Нилом Хукриде (Университет Питтсбурга).
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
Referências
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish – emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
- Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
- Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
- Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
- McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
- Diep, C. Q., et al. Development of the zebrafish mesonephros. Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. . The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).
- Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
- Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
- Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Biologia do Desenvolvimento. 256 (2), 221-241 (2003).
- Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).
