Le principali caratteristiche neuropatologiche del PD sono la neurodegenerazione cronica progressiva dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNc) e la presenza di corpi di Lewy contenenti α-sinucleina1. Poiché i neuroni dopaminergici SNc proiettano i loro assoni nello striato attraverso la via nigrostriatale, la neurodegenerazione dei neuroni in SNc provoca un deficit dopaminergico nello ^striato2. L’assenza di dopamina nello striato provoca uno squilibrio nelle attività delle vie di controllo motorio dirette e indirette, che è responsabile dei principali sintomi motori del PD: acinesia (movimento lento), bradicinesia (difficoltà nei movimenti iniziali), rigidità muscolare e tremore a riposo3,4,5.

Poiché i meccanismi molecolari e fisiologici coinvolti nell’insorgenza del PD non sono ancora completamente compresi, i principali trattamenti attualmente disponibili cercano di alleviare i sintomi motori attraverso farmacoterapie, stimolazione cerebrale ^profonda6,7, terapie ^genetiche8 e trapianto di ^cellule9. Pertanto, la ricerca preclinica è fondamentale per chiarire i meccanismi coinvolti nell’insorgenza della PD e scoprire nuove metodologie per la diagnosi precoce e nuove terapie per prevenire o fermare la degenerazione dei neuroni affetti da ^PD10.

I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per simulare la patologia umana in laboratorio, contribuendo al progresso della medicina e della scienza11,12,13,14. Tuttavia, è essenziale sottolineare che la scelta corretta del modello animale è fondamentale per il successo dello studio. Pertanto, il modello animale deve essere validato in tre aspetti principali: i) validità facciale, in cui il modello animale deve avere le caratteristiche della patologia umana; ii) validità costruttiva, in cui il modello animale deve avere una solida base teorica; e iii) validità predittiva, in cui i modelli animali devono rispondere ai trattamenti in modo simile al trattamento clinico.

Attualmente, diversi animali sono usati come modelli animali per PD. I gruppi principali includono mammiferi, come roditori, primati, minipig, cani e gatti e altri gruppi come drosophila e zebrafish. I roditori sono il modello animale più classico per PD e il più utilizzato per la loro facilità di manipolazione e manutenzione. Inoltre, l’anatomia e i meccanismi molecolari, cellulari e farmacologici del PD sono simili nei roditori e negli esseri ^umani15.

Una revisione pubblicata da Kin e colleghi nel 2019 ha analizzato le principali metodologie di modelli animali utilizzate per il PD negli anni 2000 e ha scoperto che il modello animale più utilizzato coinvolgeva neurotossine come la 6-idrossidopamina (6-OHDA) e l’1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP). Entrambe le neurotossine causano disregolazione mitocondriale nei neuroni dopaminergici nella via nigrostriatale, portando alla morte ^cellulare16. Un altro modello ampiamente utilizzato prevede la manipolazione genetica attraverso la mutazione in geni specifici coinvolti nell’insorgenza della PD, causando la disregolazione ^{mitocondriale17}. I modelli di neurotossina sono comunemente usati per valutare e confrontare le terapie, mentre i modelli genetici sono usati per studiare lo sviluppo di terapie preventive e ^PD15 idiopatiche.

La neurotossina MPTP è stata scoperta per causare parkinsonismo a metà degli anni 1980 dopo che sette pazienti hanno usato la sostanza e hanno mostrato gravi sintomi di PD. Oltre ai sintomi, i pazienti hanno risposto al trattamento con L-DOPA, che ha fatto sì che i ricercatori collegassero la molecola direttamente al PD. Dopo che il caso è stato pubblicato nel 1986, diversi ricercatori hanno iniziato a utilizzare MPTP nella ricerca preclinica sul ^PD18. I ricercatori hanno scoperto che essendo una molecola lipofila, MPTP può attraversare la barriera emato-encefalica (BBB) ed essere convertito in MPP ^{+ 19}. Questa sostanza tossica si accumula all’interno dei neuroni e provoca danni al complesso 1 della catena respiratoria mitocondriale, portando alla morte dei neuroni ^{dopaminergici20}.

Il modello di neurotossina 6-OHDA è stato utilizzato per la prima volta per indurre la degenerazione dei neuroni monoamminici della via nigrostriatale nel ¹⁹⁶⁸²¹. Il modello 6-OHDA è comunemente usato per causare neurodegenerazione nella via nigrostriatale in quanto è un analogo della dopamina e tossico per le cellule contenenti catecolamine. Dopo che il 6-OHDA entra nel cervello, può essere assorbito dal trasportatore della dopamina (DAT) nei neuroni dopaminergici, portando alla degenerazione della via nigrostriatale22. Poiché il 6-OHDA non penetra nella BBB, deve essere somministrato direttamente attraverso l’iniezione stereotassica intracerebrale23. Un inibitore della ricaptazione della noradrenalina è spesso combinato con la microiniezione 6-OHDA per preservare le fibre noradrenergiche e fornire una degenerazione più selettiva dei neuroni dopaminergici24.

Dopo che il DAT assume 6-OHDA, si accumulerà nel citosol dei neuroni, producendo specie reattive dell’ossigeno (ROS) e portando alla morte ^cellulare15. Vengono frequentemente utilizzati tre diversi modelli di lesioni di 6-OHDA: i) lesioni alla ^SNc25,26; ii) lesioni allo ^striato27,28; iii) lesioni al ^MFB29,30. Le lesioni causate nello striato provocano una degenerazione lenta e retrograda dei neuroni dopaminergici in SNpc. Al contrario, le lesioni causate in SNpc e MFB provocano una degenerazione rapida e totale dei neuroni, portando a sintomi parkinsoniani più ^avanzati31.

L’iniezione unilaterale o bilaterale di 6-OHDA può causare neurodegenerazione nei neuroni dopaminergici. 6-OHDA non sempre causa gravi danni ai neuroni; a volte, l’iniezione provoca danni parziali, che viene anche utilizzato per simulare le prime fasi di ^PD32. L’iniezione unilaterale è più comunemente usata a causa della capacità del modello di valutare i deficit motori dell’animale e prevedere la perdita cellulare attraverso test come la rotazione indotta da anfetamine / apomorfina e il test di ^stepping29. Le iniezioni bilaterali sono più utilizzate per valutare la memoria spaziale e il ^{riconoscimento33}.

Il test di rotazione indotto da anfetamine / apomorfina è un test comportamentale comunemente usato per prevedere la perdita cellulare nella via nigrostriatale. È definito come un processo in cui la somministrazione ripetuta di agonisti della dopamina porta ad un’intensificazione del comportamento rotazionale in animali 6-OHDA-lesionati34. Il comportamento rotazionale consiste nel quantificare la rotazione ipsilaterale indotta dalle anfetamine o le svolte controlaterali indotte dall’apomorfina nei roditori unilateralmente lesionati. Il comportamento rotazionale indotto da farmaci è stato criticato perché la rotazione non corrisponde ai sintomi del PD negli esseri umani e può essere influenzata da variabili come tolleranza, sensibilizzazione e “priming”³⁵.

L’adescamento è uno dei fattori più critici in questi test comportamentali. Sono stati riportati alcuni casi in cui una singola dose di L-DOPA ha portato a un fallimento nei comportamenti ^{rotazionali36}. Inoltre, un altro fattore critico correlato all’applicazione combinata del test indotto dalle anfetamine e del test indotto dall’apomorfina per uso parallelo è che misurano diversi endpoint a causa di diversi meccanismi d’azione, riflettendo l’inattivazione di diversi meccanismi e percorsi di segnalazione. Inoltre, il test indotto dalle anfetamine è più accurato per misurare le lesioni nigrostriatali superiori al 50-60%, mentre il test indotto dall’apomorfina è più accurato per le lesioni superiori all’80%³⁷.

Il test di passo è emerso come un test comportamentale che indica deficit legati alla degenerazione neuronale dopaminergica e agli effetti terapeutici. Consente l’analisi dell’acinesia causata da una lesione 6-OHDA nei neuroni dopaminergici senza una procedura indotta da farmaci. Inoltre, il test è stato ben consolidato e comunemente usato dal 1995, quando è stato descritto per la prima volta da Olsson et ^al.35. Nel 1999, Chang et ^al.38 hanno anche analizzato e confrontato le prestazioni dei ratti nel test di stepping con il livello di degenerazione causato da 6-OHDA e hanno scoperto che gli animali che hanno ottenuto risultati peggiori nel test di stepping avevano anche una degenerazione più significativa dei neuroni dopaminergici.

Il test di stepping è un metodo eccellente per prevedere un grave danno nigrostriatale dopaminergico nei ratti 6-OHDA-lesionati. L’evidenza suggerisce che i deficit motori compaiono nell’arto anteriore controlaterale dell’infusione di 6-OHDA durante il test di stepping quando il grado di perdita dopaminergica in SNc è >90%³⁹. Questo documento descrive i protocolli, le metodologie e i materiali utilizzati per eseguire la chirurgia stereotassica per l’infusione unilaterale di 6-OHDA nell’MFB dei ratti e come prevedere le lesioni dopaminergiche causate dalla tossina attraverso il test di stepping.