Netwerkactiviteit opnemen in spinale nociceptieve circuits met behulp van micro-elektrodearrays
Summary
Het gecombineerde gebruik van micro-elektrode array-technologie en 4-aminopyridine-geïnduceerde chemische stimulatie voor het onderzoeken van nociceptieve activiteit op netwerkniveau in de dorsale hoorn van het ruggenmerg wordt geschetst.
Abstract
De rollen en connectiviteit van specifieke soorten neuronen in de dorsale hoorn van het ruggenmerg (DH) worden in een snel tempo afgebakend om een steeds gedetailleerder beeld te geven van de circuits die ten grondslag liggen aan de verwerking van spinale pijn. De effecten van deze verbindingen voor bredere netwerkactiviteit in de DH blijven echter minder goed begrepen omdat de meeste studies zich richten op de activiteit van enkele neuronen en kleine microcircuits. Als alternatief biedt het gebruik van micro-elektrode arrays (MEA’s), die de elektrische activiteit in veel cellen kunnen volgen, een hoge ruimtelijke en temporele resolutie van neurale activiteit. Hier wordt het gebruik van MEA’s met muisplakken van het ruggenmerg beschreven om DH-activiteit te bestuderen die wordt geïnduceerd door chemisch stimulerende DH-circuits met 4-aminopyridine (4-AP). De resulterende ritmische activiteit is beperkt tot de oppervlakkige DH, stabiel in de tijd, geblokkeerd door tetrodotoxine, en kan worden onderzocht in verschillende plakoriëntaties. Samen biedt dit preparaat een platform om dh-circuitactiviteit in weefsel van naïeve dieren, diermodellen van chronische pijn en muizen met een genetisch veranderde nociceptieve functie te onderzoeken. Bovendien kunnen MEA-opnames in 4-AP-gestimuleerde ruggenmergplakken worden gebruikt als een snelle screeningtool om het vermogen van nieuwe antinociceptieve verbindingen te beoordelen om de activiteit in het ruggenmerg DH te verstoren.
Introduction
De rollen van specifieke soorten remmende en exciterende interneuronen in het ruggenmerg DH worden in een snel tempo blootgelegd 1,2,3,4. Samen vormen interneuronen meer dan 95% van de neuronen in de DH en zijn ze betrokken bij sensorische verwerking, inclusief nociceptie. Bovendien zijn deze interneuroncircuits belangrijk om te bepalen of perifere signalen de neuroaxis opstijgen om de hersenen te bereiken en bijdragen aan de perceptie van pijn 5,6,7. Tot op heden hebben de meeste studies de rol van DH-neuronen op het niveau van analyse van één cel of het hele organisme onderzocht met behulp van combinaties van in vitro intracellulaire elektrofysiologie, neuroanatomische etikettering en in vivo gedragsanalyse 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Deze benaderingen hebben het begrip van de rol van specifieke neuronpopulaties bij pijnverwerking aanzienlijk verbeterd. Er blijft echter een kloof bestaan in het begrijpen hoe specifieke celtypen en kleine macrocircuits grote populaties neuronen op microcircuitniveau beïnvloeden om vervolgens de output van de DH, gedragsreacties en de pijnervaring vorm te geven.
Een technologie die macrocircuits of meercellige functies kan onderzoeken, is de micro-elektrode array (MEA)15,16. MEAs worden al tientallen jaren gebruikt om de werking van het zenuwstelsel te onderzoeken17,18. In de hersenen hebben ze de studie van neuronale ontwikkeling, synaptische plasticiteit, farmacologische screening en toxiciteitstests vergemakkelijkt17,18. Ze kunnen worden gebruikt voor zowel in vitro als in vivo toepassingen, afhankelijk van het type MEA. Bovendien is de ontwikkeling van MEA’s snel geëvolueerd, met verschillende elektrodenummers en configuraties die nu beschikbaarzijn 19. Een belangrijk voordeel van MEA’s is hun vermogen om tegelijkertijd elektrische activiteit in veel neuronen te beoordelen met een hoge ruimtelijke en temporele nauwkeurigheid via meerdere elektroden15,16. Dit biedt een bredere uitlezing van hoe neuronen interageren in circuits en netwerken, onder controleomstandigheden en in de aanwezigheid van lokaal toegepaste verbindingen.
Een uitdaging van in vitro DH-preparaten is dat de voortdurende activiteitsniveaus meestal laag zijn. Hier wordt deze uitdaging aangepakt in DH-circuits van het ruggenmerg met behulp van de voltage-gated K + kanaalblokker, 4-aminopryidine (4-AP), om DH-circuits chemisch te stimuleren. Dit medicijn is eerder gebruikt om ritmische synchrone elektrische activiteit vast te stellen in de DH van acute ruggenmergplakken en onder acute in vivo omstandigheden 20,21,22,23,24. Deze experimenten hebben eencellige patch en extracellulaire opname of calciumbeeldvorming gebruikt om 4-AP-geïnduceerde activiteit 20,21,22,23,24,25 te karakteriseren. Samen heeft dit werk de vereiste aangetoond van exciterende en remmende synaptische transmissie en elektrische synapsen voor ritmische 4-AP-geïnduceerde activiteit. De 4-AP-respons wordt dus gezien als een benadering die inheemse polysynaptische DH-circuits met biologische relevantie ontmaskert in plaats van als een door geneesmiddelen geïnduceerd epifenomeen. Bovendien vertoont 4-AP-geïnduceerde activiteit een vergelijkbaar responsprofiel op analgetische en anti-epileptica als neuropathische pijnaandoeningen en is het gebruikt om nieuwe spinale analgetische medicijndoelen voor te stellen, zoals connexinen 20,21,22.
Hier wordt een preparaat beschreven dat MEAs en chemische activering van de spinale DH combineert met 4-AP om deze nociceptieve circuits op macrocircuit of netwerkniveau van analyse te bestuderen. Deze aanpak biedt een stabiel en reproduceerbaar platform voor het onderzoeken van nociceptieve circuits onder naïeve en neuropathische ‘pijnachtige’ omstandigheden. Deze voorbereiding is ook gemakkelijk toepasbaar om de werking op circuitniveau van bekende analgetica te testen en om nieuwe analgetica in het hyperactieve ruggenmerg te screenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks het belang van de spinale DH bij nociceptieve signalering, verwerking en de resulterende gedrags- en emotionele reacties die pijn kenmerken, blijven de circuits binnen deze regio slecht begrepen. Een belangrijke uitdaging bij het onderzoeken van dit probleem is de diversiteit van neuronpopulaties waaruit deze circuitsbestaan 6,31,32. Recente ontwikkelingen in transgene technologieën, geleid door optogenetica en chemogen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de National Health and Medical Research Council (NHMRC) van Australië (subsidies 631000, 1043933, 1144638 en 1184974 aan B.A.G. en R.J.C.) en het Hunter Medical Research Institute (subsidie aan B.A.G. en R.J.C.).
Materials
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
Referências
- Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190 (2019).
- Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
- Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
- Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32 (2020).
- Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. Itch and neuropathis itch. Pain. 159 (3), 603 (2018).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
- Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
- Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
- Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2015).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
- Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
- Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854 (2020).
- Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, 2499-2510 (2009).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
- Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852 (2016).
- Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
- Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
- Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
- Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
- Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
- Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
- Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
- Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
- Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
- Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
- Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
- Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neurociência. 61 (4), 991-1006 (1994).
- Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
- Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
- Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
- Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neurociência. 126 (2), 511-520 (2004).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
- Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).
