Mitochondriën zijn dynamische subcellulaire organellen en worden beschouwd als de celkrachtcentrales voor energieproductie. Aan de andere kant kunnen mitochondriën Ca²⁺ opnemen in de matrix als reactie op lokale of cytosolische Ca²⁺ stijgingen. Mitochondriale Ca²⁺ opname beïnvloedt de mitochondriale functie, inclusief metabole processen zoals reacties in de tricarbonzuur (TCA) cyclus en oxidatieve fosforylering, en reguleert Ca²⁺-gevoelige eiwitten onder fysiologische omstandigheden^1,2,3,4. Mitochondriale Ca²⁺ overbelasting is ook een determinant voor celdood, waaronder necrose en apoptose bij verschillende hersenaandoeningen^5,6,7. Het veroorzaakt de opening van mitochondriale permeabiliteitstransitieporiën (mPTPs) en de afgifte van caspase-cofactor, die apoptotische celdood initiëren. Daarom is het belangrijk om mitochondriale Ca^{2 +} dynamiek en behandeling in levende cellen te bestuderen om cellulaire fysiologie en pathologie beter te begrijpen.

Mitochondriën handhaven matrix Ca²⁺ homeostase door een balans tussen Ca²⁺ opname en efflux. Mitochondriale Ca²⁺ opname wordt voornamelijk gemedieerd door mitochondriale Ca²⁺ uniporters (MCU’s), terwijl mitochondriale Ca²⁺ efflux wordt gemedieerd door de Na⁺-Ca²⁺-Li⁺ wisselaars (NCLXs) en de H⁺/ Ca²⁺ wisselaars (mHCXs)⁸. Het evenwicht kan verstoord worden door de stimulatie van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR’s)⁹. Mitochondriale Ca²⁺ homeostase wordt ook beïnvloed door mitochondriale buffering door de vorming van onoplosbare xCa²⁺-xPO₄x-xOH complexen⁸.

Intracellulaire en mitochondriale veranderingen in ca²⁺ concentratie ([Ca²⁺]) kunnen worden geëvalueerd door fluorescerende of luminescerende Ca²⁺ indicatoren. Ca²⁺ binding aan indicatoren veroorzaakt spectrale modificaties, waardoor vrije cellulaire [Ca²⁺] in real-time in levende cellen kan worden vastgelegd. Er zijn momenteel twee soorten sondes beschikbaar om Ca²⁺ veranderingen in cellen te monitoren: organische chemische indicatoren en genetisch gecodeerde Ca²⁺ indicatoren (GECI’s). Over het algemeen zijn verschillende varianten met verschillende Ca²⁺ affiniteiten (gebaseerd op K_d),spectrale eigenschappen (excitatie- en emissiegolflengten), dynamische bereiken en gevoeligheden beschikbaar voor de onderzochte biologische vragen. Hoewel veel synthetische organische Ca^{2 +} -indicatoren zijn gebruikt voor cytosolische Ca^{2 +} -beeldvorming, kunnen slechts een paar selectief worden geladen in de mitochondriale matrix voor mitochondriale Ca^{2 +} -beeldvorming, waarbij Rhod-2 het meest wordt gebruikt (voor beoordelingen zie^10,11). Rhod-2 heeft echter een groot nadeel van lekkage tijdens lange tijd-cursus experimenten; bovendien is het verdeeld tussen mitochondriën, andere organellen en het cytosol, waardoor absolute metingen in verschillende subsecties moeilijk zijn. Door gebruik te maken van celtypespecifieke promotors en subcellulaire compartimentgerichte sequenties, kunnen GECI’s daarentegen worden uitgedrukt in verschillende celtypen en subcellulaire compartimenten voor cel- en compartimentspecifieke Ca²⁺ beeldvorming in vitro of in vivo. Op fluorescentie-intensiteit gebaseerde GCaMP Ca^{2+-indicatoren} met één golflengte zijn onlangs naar voren gekomen als belangrijke GECI’s^{12,13,14,15,16.} In dit artikel bieden we een protocol voor mitochondria-targeting en celtype specifieke expressie van GCaMP5G en GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) in astrocyten en neuronen, en beeldvorming mitochondriale Ca^{2 +} opname in deze celtypen. Met behulp van dit protocol kan de expressie van GCaMP6G / 6s in individuele mitochondriën worden onthuld en kan Ca^{2 +} opname in enkele mitochondriale resolutie worden bereikt in astrocyten en neuronen in vitro pt in vivo.