Her presenterer vi fabrikasjonsprotokollen til en organisk ladningsmodulert felteffekttransistor (OCMFET)-basert enhet for in vitro cellulær grensesnitt. Enheten, kalt en mikro OCMFET-matrise, er en fleksibel, rimelig og referansefri enhet, som vil muliggjøre overvåking av de elektriske og metabolske aktivitetene til elektroaktive cellekulturer.
Moderne elektrofysiologi har hele tiden blitt drevet av den parallelle utviklingen av stadig mer sofistikerte verktøy og materialer. I sin tur har funn på dette feltet drevet teknologisk fremgang i en frem og tilbake-prosess som til slutt bestemte de imponerende prestasjonene de siste 50 årene. Imidlertid presenterer de mest brukte enhetene som brukes til cellulær grensesnitt (nemlig mikroelektrode-arrayene og mikroelektroniske enheter basert på transistorer) fortsatt flere begrensninger som høye kostnader, materialets stivhet og tilstedeværelsen av en ekstern referanseelektrode. For delvis å overvinne disse problemene har det vært utviklinger i et nytt vitenskapelig felt kalt organisk bioelektronikk, noe som resulterer i fordeler som lavere kostnader, mer praktiske materialer og innovative fabrikasjonsteknikker.
Flere interessante nye organiske enheter har blitt foreslått i løpet av det siste tiåret for å enkelt koble seg til cellekulturer. Dette dokumentet presenterer protokollen for fabrikasjon av enheter for cellulær grensesnitt basert på den organiske ladningsmodulerte felteffekttransistoren (OCMFET). Disse enhetene, kalt micro OCMFET arrays (MOAs), kombinerer fordelene med organisk elektronikk og de særegne egenskapene til OCMFET for å forberede gjennomsiktige, fleksible og referanseløse verktøy som det er mulig å overvåke både de elektriske og metabolske aktivitetene til kardiomyocytter og nevroner in vitro, og dermed tillate en multiparametrisk evaluering av elektrogene cellemodeller.
In vivo overvåking av elektroaktive celler, som nevroner og kardiomyocytter, representerer en gyldig og kraftig tilnærming i grunnleggende forskningsapplikasjoner for den menneskelige hjerne, funksjonelle tilkoblingsstudier, farmakologi og toksikologi. Verktøyene som vanligvis brukes til slike studier er hovedsakelig basert på mikroelektrode arrays (MEAs)1,2,3,4,5 og stadig mer effektive og kraftige felteffektenheter (FEDs)6,7,8,9,10,11,12 . Disse to familiene av enheter tillater sanntidsovervåking og stimulering av nevroners elektriske aktivitet og kardiomyocytter og er vanligvis preget av robusthet, brukervennlighet og pålitelighet. Disse funksjonene gjør MEAer og FEDs til gullstandarden for elektrofysiologiske applikasjoner, som for tiden brukes til grensesnitt med standard cellulære kulturer, organotypiske hjerneskiver og tridimensionale organoider13,14,15,16. Til tross for deres utbredte bruk og deres imponerende egenskaper, presenterer MEAer og FEDer noen begrensninger som høye kostnader, materialets stivhet og tilstedeværelsen av en vanligvis stor referanseelektrode, som må plasseres i målevæskemiljøet og er nødvendig for riktig drift av enhetene.
For å utforske alternative løsninger for cellulær grensesnitt har det det siste tiåret blitt investert mye arbeid i studiet av elektroniske enheter basert på organiske materialer og innovative fabrikasjonsteknikker17. Blant de flere organiske enhetene som er studert for å adressere de nevnte begrensningene, har en merkelig organisk transistor kalt OCMFET nylig blitt foreslått som et gyldig alternativ til MEAer og FEDs18. I tillegg til standardfunksjonene som tilbys av den organiske elektronikkteknologien, for eksempel billige materialer og fabrikasjonsteknikker, optimale mekaniske og kjemiske egenskaper, optisk gjennomsiktighet og biokompatibilitet, tilbyr OCMFET også en ultrahøy ladefølsomhet (på grunn av sin dobbeltporterte struktur) uten behov for en ekstern referanseelektrode. Videre har denne organiske sensoren den bemerkelsesverdige evnen til å registrere forskjellige analytt / fysiske parametere, avhengig av den spesifikke funksjonaliseringen av sensorområdet, som er skilt fra transistorområdet19,20. Alle disse funksjonene kan enkelt utnyttes for oppkjøp av forskjellige parametere i en cellulær kultur. Spesielt, i tillegg til å kunne oppdage den nevronale / hjerte elektriske aktiviteten, er det også mulig å utnytte den ultrahøye pH-følsomheten som tilbys av den særegne dobbeltportede strukturen til OCMFET ved å bruke en enkel fysisk funksjonalisering21 for pålitelig å overvåke de små lokale pH-variasjonene forårsaket av cellulær metabolsk aktivitet.
Ved de vitro-celle-biosensing er overvåking av cellulær metabolsk aktivitet en kraftig indikator på kulturens tilstand og kan brukes til å vurdere cellulær respons på ulike stimuli, for eksempel legemiddeladministrasjon og elektrisk stimulering22,23. Videre, i det spesifikke tilfellet av nevrale applikasjoner, overvåke både elektriske og metabolske aktiviteter er av stor interesse, spesielt i farmakologi og toksikologi24. Med den hensikt å enkelt adressere kravene til moderne in vitro elektrofysiologi, samtidig som den tilbyr alle fordelene med OCMFET, har en enhet som heter Micro OCMFET Array (MOA) nylig blitt introdusert. MOA er et OCMFET-basert array med spesialiserte sensorområder spesielt designet for in vitro cellulær interfacing, noe som muliggjør multiparametrisk analyse av elektrogene cellekulturer. Spesielt har to MOA-kanaler større sensorområder for å maksimere følsomheten og kan selektivt funksjonaliseres for å overvåke spesifikke interesseparametere, for eksempel pH-variasjonene i kulturmediet. De andre OCMFETene i strukturen fungerer som ekstracellulære elektriske aktivitetssensorer. Figur 1 viser strukturen til en 16-kanals MOA. Denne evnen, kombinert med fravær av en ekstern referanseelektrode, gjør MOA til et veldig interessant verktøy for in vitro-applikasjoner. Dette arbeidet presenterer den trinnvise fabrikasjonsprotokollen til en multisenserende MOA for in vitro-deteksjon av nevroners elektriske og metabolske aktiviteter og kardiomyocytter. Figur 2 viser de viktigste fabrikasjonstrinnene, materialene som brukes, og enhetsstrukturen.
I motsetning til tidligere metoder for fabrikasjon av OCMFETs for cellulære applikasjoner18,29, er den foreslåtte metoden spesielt designet for å forberede MOAer som samtidig kan oppdage elektrisk og metabolsk cellulær aktivitet. Videre har denne tilnærmingen for å oppnå pH-følsomhet fordelen av å være kompatibel med standard fabrikasjonsprotokoller og innebærer ingen kjemisk modifikasjon av sensorområdet (dette aspektet sikrer biokompatibiliteten til hele enheten). pH-følsomheten oppnås ved hjelp av det samme materialet som brukes som en port dielektrisk (dvs. den biokompatible Parylen C), noe som gjør denne tilnærmingen rask og reproduserbar.
Det endelige resultatet av denne tilnærmingen er et fleksibelt, gjennomsiktig, rimelig og multisensing organisk verktøy for in vitro mobilapplikasjoner. Det faktum at dette kan oppnås ved hjelp av en enkelt transistorstruktur og en enkel fysisk modifikasjon av sensorområdet, legger til fordelene ved bruk av organiske elektroniske materialer og metoder. Videre, fordi transduksjonsprinsippet til OCMFET ikke strengt avhenger av det spesifikke halvleder- eller FG-materialet, kan hele prosessen endres og oppskalers avhengig av den spesifikke applikasjonen.
Et kritisk aspekt av den foreslåtte teknikken er relatert til reproduserbarheten av plasmaaktiveringsteknikken. For å oppnå konsistente resultater må både Parylen C-tykkelsen og etsehastigheten kontrolleres. Hyppig kalibrering av Parylene C-avsetningsprosessen og plasmarenseren er absolutt nødvendig. Andre kritiske aspekter, som også bidrar til prosessens reproduserbarhet, er forsiktig håndtering av enheten og avsetningen av den organiske halvlederen. En enkel drop-casting teknikk ble brukt her, som iboende utgjør reproduserbarhetsbegrensninger. For å minimere disse problemene, som beskrevet i protokolltrinn 10.1, bør samme mengde halvlederløsning brukes hver gang, og fordampning av løsningsmidlet bør standardiseres så mye som mulig. Å holde en konstant temperatur ved hjelp av en varm plate og dekke substratet etter hver dråpeavsetning vil bidra til å bremse fordampningsprosessen. For å minimere dette problemet ytterligere, kan avsetningsteknikken (f.eks. ved hjelp av en blekkskriverutskriftsmetode) byttes30.
En begrensning av den foreslåtte protokollen stammer fra arten av funksjonaliseringen av OCMFET for pH-sensing. Stabiliteten til pH-sensorene er begrenset til noen uker26. Stabilitetsvinduet til den foreslåtte tilnærmingen er imidlertid tilstrekkelig stort til å dekke standard inkubasjonstider som trengs for nevronkulturvekst (2-3 uker). Andre typer sensing områdefunksjonalisering bør vurderes for lengre eksperimenter. Fabrikasjonsprotokollen bruker en dedikert ryggkontakt, noe som gir elektrisk tilgang til FG-ene. Denne kontakten, som er flytende under normal drift av enheten, kan utnyttes for elektrisk karakterisering av enheten og funksjonalisering av sensorområdene ved hjelp av forskjellige teknikker (f.eks. elektrodeposisjon).
Denne prosedyren representerer en praktisk måte å forberede en flerregistreringsenhet for mobilapplikasjoner uten behov for ekspansive materialer eller renromsfasiliteter. Til tross for ytelses- og stabilitetsbegrensningene på grunn av ansettelsen av en organisk halvleder og fysisk (ikke kjemisk) funksjonalisering av sensorområdet, kan lignende tilnærminger brukes til å forberede billige (og potensielt disponible), mekanisk fleksible og optisk gjennomsiktige sensorer og biosensorer, som kan gi forskere i cellulær biologi, vevsteknikk og nevrovitenskap nye spesialiserte verktøy for å studere cellulære systemer in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erkjenner finansiering fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under tilskuddsavtale ARS01_00996 nr.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
ABS filament | |||
Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
Gold | Local seller | ||
Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
Petri dishes | |||
Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. |
|
Thermal evaporator unit | |||
TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |