Här presenterar vi tillverkningsprotokollet för en organisk laddningsmodulerad fälteffekttransistor (OCMFET)-baserad enhet för in vitro cellulär interfacing. Enheten, som kallas en mikro OCMFET-matris, är en flexibel, billig och referensfri enhet, vilket möjliggör övervakning av elektriska och metaboliska aktiviteter i elektroaktiva cellkulturer.
Modern elektrofysiologi har ständigt drivits av den parallella utvecklingen av alltmer sofistikerade verktyg och material. I sin tur har upptäckter på detta område drivit tekniska framsteg i en fram och tillbaka-process som slutligen bestämde de imponerande prestationerna under de senaste 50 åren. De mest använda enheterna som används för cellulär samverkan (nämligen mikroelektrodmatriser och mikroelektroniska enheter baserade på transistorer) uppvisar dock fortfarande flera begränsningar som hög kostnad, materialens styvhet och närvaron av en extern referenselektrod. För att delvis övervinna dessa problem har det skett en utveckling inom ett nytt vetenskapligt område som kallas organisk bioelektronik, vilket resulterat i fördelar som lägre kostnad, bekvämare material och innovativa tillverkningstekniker.
Flera intressanta nya organiska enheter har föreslagits under det senaste decenniet för att bekvämt samverka med cellkulturer. Detta dokument presenterar protokollet för tillverkning av enheter för cellulära interfacing baserat på den organiska laddningsmodulerade fält-effekt transistor (OCMFET). Dessa enheter, som kallas mikro OCMFET-matriser (MOAs), kombinerar fördelarna med organisk elektronik och de speciella egenskaperna hos OCMFET för att förbereda transparenta, flexibla och referensfria verktyg med vilka det är möjligt att övervaka både de elektriska och metaboliska aktiviteterna hos kardiomyocyter och nervceller in vitro, vilket möjliggör en multiparametrisk utvärdering av elektrogena cellmodeller.
In vivo-övervakning av elektroaktiva celler, såsom nervceller och kardiomyocyter, representerar ett giltigt och kraftfullt tillvägagångssätt i grundläggande forskningsapplikationer för den mänskliga hjärnan, funktionella anslutningsstudier, farmakologi och toxikologi. De verktyg som vanligtvis används för sådana studier är huvudsakligen baserade på mikroelektrodmatriser (MEA) 1,2,3,4,5 och allt effektivare fälteffektenheter (FEDs)6,7,8,9,10,11,12 . Dessa två familjer av enheter tillåter realtidsövervakning och stimulering av den elektriska aktiviteten hos nervceller och kardiomyocyter och kännetecknas vanligtvis av robusthet, användarvänlighet och tillförlitlighet. Dessa funktioner gör MEA och FEDs till guldstandarden för elektrofysiologiska applikationer, som för närvarande används för att samverka med vanliga cellulära kulturer, organotypiska hjärnskivor och tredimensionella organoider13,14,15,16. Trots deras utbredda användning och deras imponerande egenskaper uppvisar MEA och FEDs vissa begränsningar som hög kostnad, materialens styvhet och närvaron av en vanligtvis skrymmande referenselektrod, som måste placeras i mätvätskemiljön och är nödvändig för korrekt drift av enheterna.
För att utforska alternativa lösningar för cellulär samverkan har mycket arbete gjorts under det senaste decenniet i studier av elektroniska enheter baserade på organiska material och innovativa tillverkningstekniker17. Bland de flera organiska enheter som studerats för att ta itu med de ovannämnda begränsningarna har en märklig organisk transistor som kallas OCMFET nyligen föreslagits som ett giltigt alternativ till MEA och FEDs18. Förutom de standardfunktioner som erbjuds av den organiska elektroniktekniken, såsom billiga material och tillverkningstekniker, optimala mekaniska och kemiska egenskaper, optisk transparens och biokompatibilitet, erbjuder OCMFET också en ultrahög laddningskänslighet (på grund av sin dubbelportade struktur) utan behov av en extern referenselektrod. Dessutom har denna organiska sensor den anmärkningsvärda förmågan att känna av olika analyt/fysiska parametrar, beroende på den specifika funktionaliseringen av dess avkänningsområde, som är separerat från transistorområdet19,20. Alla dessa funktioner kan bekvämt utnyttjas för förvärv av olika parametrar inom en cellulär kultur. I synnerhet, förutom att kunna upptäcka den neuronala / hjärt elektriska aktiviteten, är det också möjligt att utnyttja den ultrahöga pH känsligheten som erbjuds av ocmfET: s märkliga dubbel-gated struktur genom att använda en enkel fysisk funktionalisering21 för att tillförlitligt övervaka de små lokala pH-variationer som orsakas av cellulär metabolisk aktivitet.
Vid de vitro-cellbiosensing är övervakningen av cellulär metabolisk aktivitet en kraftfull indikator på kulturens tillstånd och kan användas för att bedöma det cellulära svaret på olika stimuli, såsom läkemedelsadministration och elektrisk stimulering22,23. Dessutom, i det specifika fallet med neurala applikationer, övervakning av både elektriska och metabola aktiviteter är av stort intresse, särskilt inom farmakologi och toxikologi24. Med avsikten att bekvämt ta itu med kraven på modern in vitro elektrofysiologi samtidigt som den erbjuder alla fördelar med OCMFET, har en enhet som heter Micro OCMFET Array (MOA) nyligen introducerats. MOA är en OCMFET-baserad matris med specialiserade avkänningsområden speciellt utformade för in vitro cellulär interfacing, vilket möjliggör multiparametrisk analys av elektrogena celler kulturer. I synnerhet har två MOA-kanaler större avkänningsområden för att maximera sin känslighet och kan selektivt funktionaliseras för att övervaka specifika parametrar av intresse, till exempel pH-variationerna i odlingsmediet. De andra OCMFETs i strukturen fungerar som extracellulära elektriska aktivitetssensorer. Figur 1 visar strukturen hos en 16-kanalig MOA. Denna förmåga, i kombination med avsaknaden av en extern referenselektrod, gör MOA till ett mycket intressant verktyg för in vitro-applikationer. Detta arbete presenterar steg-för-steg tillverkning protokollet av en multisensing MOA för in vitro detektion av elektriska och metabola aktiviteter av nervceller och kardiomyocyter. Figur 2 visar de viktigaste tillverkningsstegen, de material som används och enhetens struktur.
Till skillnad från tidigare metoder för tillverkning av OCMFET för cellulära applikationer18,29, är den föreslagna metoden speciellt utformad för att förbereda MOAs som samtidigt kan upptäcka elektrisk och metabolisk cellulär aktivitet. Dessutom har detta tillvägagångssätt för att uppnå pH-känslighet fördelen att det är förenligt med standardtillverkningsprotokoll och innebär ingen kemisk modifiering av avkänningsområdet (denna aspekt säkerställer biokompatibiliteten hos hela enheten). pH-känsligheten uppnås med samma material som används som en grind dielektrisk (dvs. den biokompatibla Parylen C), vilket gör detta tillvägagångssätt snabbt och reproducerbart.
Slutresultatet av denna metod är ett flexibelt, transparent, billigt och multisensing organiskt verktyg för in vitro-cellulära applikationer. Det faktum att detta kan erhållas med hjälp av en enda transistorstruktur och en enkel fysisk modifiering av avkänningsområdet bidrar till de fördelar som användningen av organiska elektroniska material och metoder erbjuder. Eftersom ocmfet-flyttningsprincipen inte strikt beror på det specifika halvledar- eller FG-materialet kan hela processen ändras och skalas upp beroende på den specifika tillämpningen.
En kritisk aspekt av den föreslagna tekniken är relaterad till reproducerbarheten av plasma aktivering teknik. För att uppnå konsekventa resultat måste både Parylen C-tjockleken och dess etsningshastighet kontrolleras. Frekvent kalibrering av Parylen C-deponeringsprocessen och plasmarengöraren är absolut nödvändiga. Andra kritiska aspekter, som också bidrar till processens reproducerbarhet, är noggrann hantering av enheten och nedfallet av den organiska halvledaren. En enkel drop-casting teknik användes här, som i sig utgör reproducerbarhet begränsningar. För att minimera dessa problem, som beskrivs i protokollsteg 10.1, bör samma mängd halvledarlösning användas varje gång, och lösningsmedelsavdunstning bör standardiseras så mycket som möjligt. Att hålla en konstant temperatur med hjälp av en värmeplatta och täcka substratet efter varje droppdeposition hjälper till att bromsa avdunstningsprocessen. För att ytterligare minimera detta problem kan depositionstekniken (t.ex. med hjälp av en bläckstråleutskriftsmetod) bytas30.
En begränsning av det föreslagna protokollet härrör från arten av funktionaliseringen av OCMFET för pH-avkänning. Stabiliteten hos pH-sensorerna är begränsad till några veckor26. Stabilitetsfönstret i det föreslagna tillvägagångssättet är dock tillräckligt stort för att täcka de standardinkubationstider som behövs för neuronal odlingstillväxt (2-3 veckor). Andra typer av avkänningsområdesfunktionalisering bör övervägas för längre experiment. Tillverkningsprotokollet använder en dedikerad backkontakt, vilket ger elektrisk åtkomst till FGs. Denna kontakt, som lämnas flytande under enhetens normala drift, kan utnyttjas för enhetens elektriska karakterisering och funktionalisering av avkänningsområdena med olika tekniker (t.ex. elektrodposition).
Denna procedur representerar ett bekvämt sätt att förbereda en multiavkänningsenhet för cellulära applikationer utan behov av expansiva material eller renrumsanläggningar. Trots prestanda- och stabilitetsbegränsningar på grund av anställning av en organisk halvledare och fysisk (inte kemisk) funktionalisering av avkänningsområdet, kan liknande metoder användas för att förbereda billiga (och potentiellt disponibla), mekaniskt flexibla och optiskt transparenta sensorer och biosensorer, vilket kan ge forskare inom cellbiologi, vävnadsteknik och neurovetenskap nya specialiserade verktyg för att studera cellulära system in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för bidragsavtal nr 882897-Search&Rescue-projektet och PON-projektet “TEX-STYLE” ARS01_00996, PNR 2015-2020.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | 440159 | |
3D printer Makerbot Replicator 2x | Makerbot | https://www.makerbot.gr/. Estimated price: 2k-3k euros. | |
ABS filament | |||
Anisole | Sigma Aldrich | 296295 | |
Bromograph model Hellas | Bungard | https://www.bungard.de/. Estimated price: 1k-2k euros. | |
Gold | Local seller | ||
Hydrofluoric acid | Sigma Aldrich | 695068 | |
Iodine | Sigma Aldrich | 207772 | |
Kapton tape | polyimide insulation tape | ||
Laser cutter VLS2.30 | Universal Laser Systems | https://www.ulsinc.com/it. Estimated price: 20k euros. | |
Multichannel Systems acquisition board | www.multichannelsystems.com | ||
NaOH pellets | Sigma Aldrich | 567530 | |
Parylene C dimer | SCS special coating systems coating | ||
PDMS Silgard 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
PDS 2010 LABCOATER 2 Parylene Deposition System | SCS special coating systems | https://scscoatings.com/. Estimated price: 50k euros | |
PET film biaxially oriented (thickness 0.25 mm) | Goodfellow | ES301450 | |
Petri dishes | |||
Plasma cleaner Gambetti "Tucano" | Gambetti | https://www.gambetti.it/. Estimated price: 20k euros. | |
Positive photoresist AZ1518 | MicroChemicals | ||
Potassium iodide KI | Sigma Aldrich | 221945 | |
Source Meter 2636 | Keithley | https://it.farnell.com/. Estimated price: 18k euros | |
Spin coater unit | Ossila | https://www.ossila.com/. Estimated price: 2.5k euros. | |
Stereoscopic microscope SMZ745T | Nikon | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/. Estimated price: 2k-3k euros. |
|
Thermal evaporator unit | |||
TIPS pentacene (6,13-Bis(triisopropylsilylethynyl)-pentacene) | Sigma Aldrich | 716006 | |
Titanium wire | Goodfellow | TI005129 | |
Ultrasonic bath | Falc Instruments | https://www.falcinstruments.it/. Estimated price: 1k euro. |