Işık fotosentez, bitki büyümesi ve gelişme için gereklidir. Işık yoğunlukları sadece bir mevsim veya gün boyunca değil, aynı zamanda bulut örtüsüne bağlı olarak hızlı ve öngörülemeyen şekillerde değiştiği için en dinamik abiyotik faktörlerden biridir. Yaprak seviyesinde, ışık yoğunlukları da çevredeki bitki örtüsünün ve bitkinin kendi gölgeliğinin yoğunluğundan ve doğasından etkilenir. Bitkilerin değişken ışık koşullarında ışık kesmeyi optimize etmelerini sağlayan önemli bir mekanizma, kloroplastların mavi ışık uyaranlarına yanıt olarak hareket ^{edebilmesidir1,2}. Düşük ışık koşullarında, kloroplastlar ışığa (periclinal hücre duvarları boyunca) dik olarak, sözde bir biriktirme tepkisiyle yayılır, ışık kesmeyi ve dolayısıyla fotosentezi en üst düzeye çıkarır. Yüksek ışık koşullarında, kloroplastlar anticlinal hücre duvarına doğru kaçınma tepkisi olarak hareket eder ve ışık kesmeyi ve fotoinhibisyon tehlikesini en aza indirir. Birçok türde, kloroplastlar ayrıca birikim ve kaçınma pozisyonlarından farklı ve genellikle ^{bu ikisi arasında} aracı olan belirli bir karanlık pozisyon üstlenir^. Çeşitli çalışmalar kloroplast hareketinin sadece yaprakların kısa süreli stres toleransı için değil^, aynı zamanda bitkilerin büyümesi ve üreme başarısı için, özellikle değişken ışık koşullarında önemli olduğunu ^{göstermiştir8,9}.

Kloroplast hareketi, hafif mikroskopi1 kullanılarak bazı canlı örneklerde (örneğin, algler veya Elodea gibi ince yapraklı bitkiler) gerçek zamanlı olarak kolayca gözlenir. Bununla birlikte, çoğu yapraktaki kloroplast hareketini incelemek, örnekleri hafif bir mikroskop altında görüntülemeden önce kloroplast hareketini, kimyasal fiksasyonu ve kesitlerin hazırlanmasını teşvik etmek için bir ön işlem ^gerektirir10. Konfokal lazer mikroskopinin devreye girmesiyle kloroplastların 3D düzenini sağlam veya sabit yapraklarda görüntüleyebilmiştir4,11,12. Bu görüntüleme teknikleri önemli nitel bilgiler sağlayarak kloroplast hareketinin anlaşılmasına büyük ölçüde yardımcı olmaktır. Kloroplast konumlandırmasının ölçülmesi (örneğin, bu görüntülerdeki periklinal veya anticlinal pozisyonlardaki kloroplastların yüzdesi veya toplam hücre yüzeyi başına kloroplastların kapladığı alan yüzdesi olarak) da mümkündür, ancak özellikle konumlandırmada hızlı değişiklikleri yakalamak için gerekli aralıklarla yapılırsa oldukça zaman ^{alıcıdır10,8} . Belirli bir türün veya mutantların koyu adapte olmuş yapraklarının kaçınma tepkisine kloroplast hareketi yapıp yapamayacağını göstermenin en basit yolu, yaprağın bir şeridini yüksek ışığa maruz bırakırken kloroplastları karanlıkta tutmak için bir yaprağın alanının çoğunu örtmektir. En az 20 dakikalık yüksek ışığa maruz kaldıktan sonra, maruz kalan bölgedeki kloroplastlar kaçınma pozisyonuna taşınmış olacak ve açık şerit yaprağın geri kalanından gözle görülür şekilde daha açık renkte olacaktır. Bu, vahşi A tipi A. thaliana için geçerlidir, ancak daha sonra ^13’te daha ayrıntılı olarak açıklanan bazı kloroplast hareketi mutantları için geçerli değildir. Bu yöntem ve modifikasyonları (örneğin, yaprağın hangi kısımlarının açığa çıktığı, ışık yoğunluklarını değiştirmek) çok sayıda mutantın taranması ve kaçınma veya biriktirme yanıtı veya her ikisi de sergilenebilme yeteneğinden yoksun boş mutantları tanımlamak için yararlıdır. Ancak kloroplast hareketlerindeki dinamik değişiklikler hakkında bilgi vermez.

Buna karşılık, burada açıklanan yöntem, genel kloroplast hareketi için bir proxy olarak bir yaprak aracılığıyla ışık iletiminde değişiklikler kullanarak bozulmamış yapraklarda kloroplast hareketinin nicelleştirilmesine izin verir: kloroplastların birikim yanıtındaki mezofil hücrelerinde yayıldığı koşullarda, yaprak yoluyla birçok kloroplastın kaçınma tepkisinde olduğundan daha az ışık iletilir, kendilerini anticlinal hücre duvarları boyunca konumlandırmak. Bu nedenle, iletimdeki değişiklikler ^{leaves14’teki} genel kloroplast hareketi için bir proxy olarak kullanılabilir. Cihazın ayrıntıları başka bir yerde açıklanmıştır (bkz. Tamamlayıcı Dosya), ancak temel olarak, cihaz kloroplast hareketini tetiklemek için mavi ışık kullanır ve belirli aralıklarla bu yapraktan ne kadar kırmızı ışık geçtiğini ölçer. Daha yakın zamanda, değiştirilmiş bir 96 kuyu mikro plaka okuyucusu, mavi bir LED, bir bilgisayar ve sıcaklık kontrollü bir ^{inkübatör15} kullanan bu sistemin bir modifikasyonu tanımlanmıştır.

Tarama için yaprakların optik değerlendirmesi, ardından iletimdeki dinamik değişikliklerin ölçülmesi ve mikroskopi kullanımı da dahil olmak üzere yöntemlerin bir kombinasyonunu kullanma seçeneği, hem alttaki mekanizmaları hem de kloroplast hareketinin fizyolojik / ekolojik önemini anlamamıza büyük ölçüde yardımcı olmuştur. Örneğin, hareketlerinin belirli yönlerinde bozulan çeşitli mutantların keşfedilmesine ve karakterizasyonuna yol açtı. Örneğin, A. thaliana phot 1 mutantları kloroplastlarını düşük ışıkta biriktirme yeteneğinden yoksunken, phot 2 mutantları kaçınma reaksiyonu gerçekleştirme yeteneğinden yoksundir. Bu fenotipler, ilgili iki mavi ışık reseptöründeki bir bozulmadan kaynaklanmaktadır16,17,18. Buna karşılık, chup1 mutantları, kloroplastları bir hücre içinde istenen konuma taşımak için gerekli olan kloroplastların etrafında uygun aktivasyon filamentleri oluşturma yeteneğinden ^{yoksundur11,19}. Mutant çalışmalara ek olarak, araştırmacılar sürecin mekanistik yönlerini aydınlatmak için çeşitli inhibitörlerin kloroplast hareketi üzerindeki etkilerini değerlendirmişlerdir. Örneğin, bu sinyal molekülünün kloroplast hareketi üzerindeki etkilerini araştırmak için _H2O2 ve çeşitli antioksidanlar gibi kimyasallar ^{kullanılmıştır20}. Kloroplast hareketinde kalsiyumun rolünü aydınlatmak için çeşitli inhibitörler ^{kullanılmıştır21}. Kloroplast hareketinin mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olup, bu yöntemler, bu davranışın ekolojik ve evrimsel bağlamını anlamak amacıyla çeşitli türlerde veya farklı koşullarda yetişen mutantlardaki kloroplast hareketini karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, kloroplast hareket yolundaki çeşitli mutasyonların etkilerinin boyutunun büyüme koşullarına bağlı olduğu ^{gösterilmiştir7,9} ve güneşe uyarlanmış bitkilerin kloroplastlarını çok fazla hareket ettirmiyor gibi görünmektedir. Buna karşılık, gölge bitkileri için hareket çok önemlidir10,22,23.

Bu yöntemler kağıt, model bitki A. thaliana odaklanmış, daha önce geliştirilmiş bir ^{enstrümanın} güncellenmiş bir sürümü olan bir iletim cihazının nasıl kullanılacağını açıklar9. Bu cihaz ticari olarak mevcut olmasa da, temel bir elektronik anlayışına veya mühendislik veya fizik meslektaşlarının ve öğrencilerin yardımına sahip kişiler, uygun fiyatlı parçalar kullanarak ve ayrıntılı talimatları izleyerek cihazı inşa edebilecektir (bkz. Enstrümanı oluşturmak için kullanılan açık kaynaklı platform, kapsamlı bir web desteğine ve sorunlar ortaya çıktığında yardım sunan bir topluluk forumuna ^sahiptir24.

Protokol, bir yaprağı çok çeşitli ışık koşullarına maruz bırakan ve A. thaliana’nın karanlık, birikim ve kaçınma reaksiyonlarını yakalayan standart bir keşif çalışmasında yaprak iletimindeki değişiklikleri belirlemek için aletin nasıl kullanılacağına odaklanır. Bu çalıştırmalar deneyin amacına bağlı olarak değiştirilebilir ve çoğu bitki türüyle kullanılabilir. Makale, A. thaliana wildtype ve birkaç mutantın iletim verilerine örnekler sunar ve verilerin nasıl daha fazla analizılacağını gösterir.