Ljus är viktigt för fotosyntes, växttillväxt och utveckling. Det är en av de mest dynamiska abiotiska faktorerna eftersom ljusintensiteter inte bara förändras under en säsong eller dag, utan också snabbt och på oförutsägbara sätt beroende på molntäcket. På bladnivå påverkas ljusintensiteterna också av densiteten och naturen hos den omgivande vegetationen och växtens egen baldakin. En viktig mekanism som gör det möjligt för växter att optimera ljusavlyssning under varierande ljusförhållanden är kloroplasternas förmåga att röra sig som svar på blå ^{ljusstimuli1,2}. Under svagt ljus sprids kloroplaster ut vinkelrätt mot ljuset (längs de periclinala cellväggarna) i ett så kallat ackumuleringssvar, vilket maximerar ljusavlyssning och därmed fotosyntes. Under höga ljusförhållanden rör sig kloroplaster mot den antiklina cellväggen i ett så kallat undvikande svar, vilket minimerar ljusavlyssning och risken för fotoinhibition. I många arter antar kloroplaster också en specifik mörk position, som skiljer sig från ackumulerings- och undvikande positioner och ofta mellanhand mellan dessa ^två3,4. Olika studier har visat att kloroplaströrelser inte bara är viktigt för den kortsiktiga stresstoleransen hos ^blad5,6,7, utan också för växters tillväxt och reproduktiva framgång, särskilt under varierande ^{ljusförhållanden8,9}.

Kloroplaströrelser observeras lätt i realtid i vissa levande exemplar (t.ex. alger eller tunnbladiga växter som Elodea) med hjälp av lätt mikroskopi1. Att studera kloroplaströrelser i de flesta blad kräver dock en förbehandling för att inducera kloroplaströrelse, kemisk fixering och beredning av tvärsnitt innan du tittar på proverna under ett ljusmikroskop10. Med införandet av konfokal lasermikroskopi blev det också möjligt att avbilda 3D-arrangemanget av kloroplaster i intakta eller fasta löv4,11,12. Dessa bildframställning tekniker i hög grad stödja förståelsen av kloroplast rörelse genom att tillhandahålla viktig kvalitativ information. Kvantifiering av kloroplastpositionering (t.ex. i procent av kloroplaster i periclinala eller antiklimatiska positioner i dessa bilder eller procentandelen yta som täcks av kloroplaster per total cellyta) är också möjlig men ganska tidskrävande, särskilt om den utförs med de intervall som krävs för att fånga snabba förändringar i ^{positionering10,8} . Det enklaste sättet att visa om mörkanpassade blad av en viss art eller mutanter kan kloroplast rörelse i undvikande svar är genom att täcka det mesta av området av ett blad för att hålla kloroplasterna i mörkret samtidigt som en remsa av bladet utsätts för högt ljus. Efter minst 20 minuters hög ljusexponering kommer kloroplasterna i det exponerade området att ha flyttats till undvikande position, och den exponerade remsan kommer att vara synligt ljusare i färg än resten av bladet. Detta gäller för vilda typ A. thaliana men inte för några av kloroplast rörelsen mutanter beskrivs mer detaljerat senare ^på13. Denna metod och modifieringar av den (t.ex. att vända vilka delar av bladet som exponeras, ändra ljusintensiteter) är användbara för att screena ett stort antal mutanter och för att identifiera nullmutanter som saknar antingen förmågan att uppvisa ett undvikande eller ackumuleringssvar eller båda. Det ger dock inte information om de dynamiska förändringarna i kloroplaströrelsen.

Däremot möjliggör den metod som beskrivs här kvantifiering av kloroplaströrelser i intakta löv med hjälp av förändringar i ljusöverföringen genom ett blad som en proxy för övergripande kloroplaströrelse: under förhållanden då kloroplaster sprids ut i mesofyllcellerna i ackumuleringssvaret överförs mindre ljus genom bladet än när många kloroplaster är i undvikande svar, positionera sig längs de antiklina cellväggarna. Därför kan förändringar i överföringen användas som en proxy för den övergripande kloroplaströrelsen i ^löv14. Detaljerna i instrumentet beskrivs någon annanstans (se Kompletterande fil), men i princip använder instrumentet blått ljus för att utlösa kloroplaströrelse och mäter hur mycket rött ljus som överförs genom det bladet med inställda intervaller. På senare tid har en modifiering av detta system beskrivits, som använder en modifierad 96-brunns mikroplatta läsare, en blå LED, en dator och en temperaturstyrd ^inkubator15.

Möjligheten att använda en kombination av metoder, inklusive optisk bedömning av blad för screening, följt av mätning av dynamiska förändringar i överföring och användning av mikroskopi, har i hög grad hjälpt vår förståelse av både de underliggande mekanismerna och den fysiologiska/ekologiska betydelsen av kloroplast rörelse. Till exempel ledde det till upptäckten och karakteriseringen av olika mutanter, som är nedsatta i specifika aspekter av deras rörelser. Till exempel saknar A. thaliana phot 1 mutanter förmågan att ackumulera sina kloroplaster i svagt ljus, medan phot 2 mutanter saknar förmågan att utföra en undvikande reaktion. Dessa fenotyper beror på en försämring i två respektive blå ljusreceptorer16,17,18. Däremot saknar chup1 mutanter förmågan att bilda ordentliga aktinfilament runt kloroplasterna som är nödvändiga för att flytta kloroplasterna till önskad position inom en ^cell11,19. Förutom mutanta studier har forskare utvärderat effekterna av olika hämmare på kloroplaströrelsen för att belysa de mekanistiska aspekterna av processen. Till exempel användes kemikalier som _H2O2 och olika antioxidanter för att undersöka effekterna av denna signalmolekyl på kloroplaströrelsen20. Olika hämmare användes för att klargöra kalciums roll i ^{kloroplaströrelsen21}. Förutom att hjälpa till att avslöja mekanismerna för kloroplaströrelse kan dessa metoder användas för att jämföra kloroplaströrelser hos olika arter eller mutanter som odlas under olika förhållanden i ett försök att förstå det ekologiska och evolutionära sammanhanget för detta beteende. Det har till exempel visat sig att omfattningen av effekterna av olika mutationer i kloroplaströrelsens rörelseväg är beroende av ^{tillväxtförhållandena7,9}, och att solanpassade växter inte verkar flytta sina kloroplaster mycket. Däremot är rörelse mycket viktigt för skuggväxter10,22,23.

Detta metodpapper, fokuserat på modellväxten A. thaliana, beskriver hur man använder en överföringsanordning som är en uppdaterad version av ett tidigare utvecklat ^instrument9. Även om detta instrument inte är kommersiellt tillgängligt, kommer personer med en grundläggande förståelse för elektronik eller hjälp av ingenjörs- eller fysikkollegor och studenter att kunna bygga instrumentet med prisvärda delar och följa de detaljerade instruktionerna (se Kompletterande fil). Plattformen med öppen källkod som används för att bygga instrumentet har omfattande webbstöd och ett communityforum som erbjuder hjälp om problem skulle ^uppstå24.

Protokollet fokuserar på hur man använder instrumentet för att bestämma förändringar i bladöverföring i en standard undersökande körning som utsätter ett blad för ett brett spektrum av ljusförhållanden och fångar de mörka, ackumulerings- och undvikande reaktionerna hos A. thaliana. Dessa körningar kan modifieras beroende på experimentets mål och kan användas med de flesta växtarter. Papperet ger exempel på överföringsdata av A. thaliana wildtype och flera mutanter och visar hur man ytterligare analyserar data.