La luz es esencial para la fotosíntesis, el crecimiento y el desarrollo de las plantas. Es uno de los factores abióticos más dinámicos, ya que las intensidades de luz no solo cambian en el transcurso de una estación o día, sino también de manera rápida e impredecible dependiendo de la cubierta de nubes. A nivel de la hoja, las intensidades de luz también están influenciadas por la densidad y la naturaleza de la vegetación circundante y el propio dosel de la planta. Un mecanismo importante que permite a las plantas optimizar la intercepción de la luz en condiciones de luz variables es la capacidad de los cloroplastos para moverse en respuesta a los estímulos de la luz ^azul1,2. En condiciones de poca luz, los cloroplastos se extienden perpendicularmente a la luz (a lo largo de las paredes celulares periclinales) en una llamada respuesta de acumulación, maximizando la intercepción de la luz y, por lo tanto, la fotosíntesis. En condiciones de alta luz, los cloroplastos se mueven hacia la pared celular anticlinal en una llamada respuesta de evitación, minimizando la intercepción de la luz y el peligro de fotoinhibición. En muchas especies, los cloroplastos también asumen una posición oscura específica, que es distinta de las posiciones de acumulación y evitación y a menudo intermediaria entre esas ^dos3,4. Diversos estudios han demostrado que el movimiento del cloroplasto no solo es importante para la tolerancia al estrés a corto plazo de las hojas5,6,7, sino también para el crecimiento y éxito reproductivo de las plantas, especialmente en condiciones de luz ^variable8,9.

El movimiento del cloroplasto se observa fácilmente en tiempo real en ciertos especímenes vivos (por ejemplo, algas o plantas de hojas delgadas como Elodea) utilizando microscopía de ^luz1. Sin embargo, el estudio del movimiento del cloroplasto en la mayoría de las hojas requiere un pretratamiento para inducir el movimiento del cloroplasto, la fijación química y la preparación de secciones transversales antes de ver las muestras bajo un microscopio de ^luz10. Con la introducción de la microscopía láser confocal, también fue posible obtener imágenes de la disposición 3D de cloroplastos en hojas intactas o fijas4,11,12. Estas técnicas de imagen ayudan en gran medida a la comprensión del movimiento del cloroplasto al proporcionar información cualitativa importante. Cuantificar el posicionamiento del cloroplasto (por ejemplo, como porcentaje de cloroplastos en las posiciones periclinal o anticlinal en estas imágenes o el porcentaje de área cubierta por cloroplastos por superficie celular total) también es posible pero requiere bastante tiempo, especialmente si se realiza a los intervalos necesarios para capturar cambios rápidos en el ^{posicionamiento10,8} . La forma más sencilla de mostrar si las hojas adaptadas a la oscuridad de una determinada especie o mutantes son capaces de mover el cloroplasto en la respuesta de evitación es cubriendo la mayor parte del área de una hoja para mantener los cloroplastos en la oscuridad mientras se expone una tira de la hoja a la luz alta. Después de un mínimo de 20 minutos de alta exposición a la luz, los cloroplastos en el área expuesta se habrán movido a la posición de evitación, y la tira expuesta será visiblemente más clara en color que el resto de la hoja. Esto es cierto para el tipo salvaje A. thaliana, pero no para algunos de los mutantes del movimiento del cloroplasto descritos con más detalle más ^adelante13. Este método y sus modificaciones (por ejemplo, invertir qué partes de la hoja están expuestas, cambiar las intensidades de la luz) son útiles para detectar un gran número de mutantes e identificar mutantes nulos que carecen de la capacidad de exhibir una respuesta de evitación o acumulación o ambas. Sin embargo, no proporciona información sobre los cambios dinámicos en el movimiento del cloroplasto.

En contraste, el método descrito aquí permite la cuantificación del movimiento del cloroplasto en hojas intactas utilizando cambios en la transmisión de luz a través de una hoja como un proxy para el movimiento general del cloroplasto: en condiciones en que los cloroplastos se extienden en las células mesófilas en la respuesta de acumulación, se transmite menos luz a través de la hoja que cuando muchos cloroplastos están en una respuesta de evitación, posicionándose a lo largo de las paredes celulares anticlinales. Por lo tanto, los cambios en la transmisión pueden ser utilizados como un proxy para el movimiento general del cloroplasto en las ^hojas14. Los detalles del instrumento se describen en otra parte (consulte el Archivo complementario), pero básicamente, el instrumento utiliza luz azul para activar el movimiento del cloroplasto y mide cuánta luz roja se transmite a través de esa hoja a intervalos establecidos. Más recientemente, se ha descrito una modificación de este sistema, que utiliza un lector de microplacas modificado de 96 pocillos, un LED azul, una computadora y una incubadora de temperatura ^controlada15.

La opción de utilizar una combinación de métodos, incluida la evaluación óptica de las hojas para el cribado, seguida de la medición de los cambios dinámicos en la transmisión y el uso de la microscopía, ha ayudado en gran medida a nuestra comprensión tanto de los mecanismos subyacentes como de la importancia fisiológica / ecológica del movimiento del cloroplasto. Por ejemplo, condujo al descubrimiento y caracterización de varios mutantes, que se ven afectados en aspectos específicos de sus movimientos. Por ejemplo, los mutantes de A. thaliana phot 1 carecen de la capacidad de acumular sus cloroplastos con poca luz, mientras que los mutantes de phot 2 carecen de la capacidad de realizar una reacción de evitación. Estos fenotipos se deben a un deterioro en dos receptores de luz azul respectivos16,17,18. Por el contrario, los mutantes chup1 carecen de la capacidad de formar filamentos de actina adecuados alrededor de los cloroplastos, que son esenciales para mover los cloroplastos a la posición deseada dentro de una ^célula11,19. Además de los estudios mutantes, los investigadores han evaluado los efectos de varios inhibidores en el movimiento del cloroplasto para dilucidar los aspectos mecanicistas del proceso. Por ejemplo, se utilizaron sustancias químicas como el _H2O2 y varios antioxidantes para investigar los efectos de esta molécula de señalización en el movimiento del cloroplasto20. Se utilizaron diversos inhibidores para dilucidar el papel del calcio en el movimiento del ^{cloroplasto21}. Además de ayudar a descubrir los mecanismos del movimiento del cloroplasto, estos métodos se pueden utilizar para comparar el movimiento del cloroplasto en varias especies o mutantes cultivados en diferentes condiciones en un intento de comprender el contexto ecológico y evolutivo de este comportamiento. Por ejemplo, se ha demostrado que el alcance de los efectos de diversas mutaciones en la vía de movimiento del cloroplasto depende de las condiciones ^{de crecimiento7,9}, y que las plantas adaptadas al sol no parecen mover mucho sus cloroplastos. Por el contrario, el movimiento es muy importante para las plantas de sombra10,22,23.

Este documento de métodos, centrado en la planta modelo A. thaliana, describe cómo utilizar un dispositivo de transmisión que es una versión actualizada de un instrumento desarrollado ^previamente9. Si bien este instrumento no está disponible comercialmente, las personas con una comprensión básica de la electrónica o la ayuda de colegas y estudiantes de ingeniería o física podrán construir el instrumento utilizando piezas asequibles y siguiendo las instrucciones detalladas (consulte el Archivo complementario). La plataforma de código abierto utilizada para construir el instrumento tiene un amplio soporte web y un foro comunitario que ofrece ayuda en caso de que surjan ^problemas24.

El protocolo se centra en cómo usar el instrumento para determinar los cambios en la transmisión de la hoja en una carrera exploratoria estándar que expone una hoja a una amplia gama de condiciones de luz y captura las reacciones de oscuridad, acumulación y evitación de A. thaliana. Estas tiradas se pueden modificar dependiendo del objetivo del experimento y se pueden utilizar con la mayoría de las especies de plantas. El documento proporciona ejemplos de datos de transmisión de A. thaliana wildtype y varios mutantes y muestra cómo analizar más a fondo los datos.