A luz é essencial para fotossíntese, crescimento das plantas e desenvolvimento. É um dos fatores abióticos mais dinâmicos, pois as intensidades de luz não só mudam ao longo de uma estação ou dia, mas também de forma rápida e imprevisível, dependendo da cobertura da nuvem. No nível da folha, as intensidades de luz também são influenciadas pela densidade e natureza da vegetação circundante e do próprio dossel da planta. Um mecanismo importante que permite que as plantas otimizem a interceptação de luz em condições de luz variável é a capacidade de os cloroplastos se moverem em resposta aos estímulos da luz ^azul1,2. Sob condições de baixa luz, os cloroplastos se espalham perpendicularmente à luz (ao longo das paredes celulares periclínicas) em uma chamada resposta de acumulação, maximizando a interceptação de luz e, portanto, a fotossíntese. Sob altas condições de luz, os cloroplastos se movem em direção à parede celular anticlinal em uma chamada resposta de evasão, minimizando a interceptação de luz e o perigo de fotoinibição. Em muitas espécies, os cloroplastos também assumem uma posição escura específica, que é distinta das posições de acumulação e evasão e muitas vezes intermediária entre esses ^dois3,4. Vários estudos têm demonstrado que o movimento do cloroplasto não é apenas importante para a tolerância ao estresse de curto prazo das ^folhas5,6,7, mas também para o crescimento e sucesso reprodutivo das plantas, especialmente em condições de luz ^variável8,9.

O movimento do cloroplasto é facilmente observado em tempo real em certos espécimes vivos (por exemplo, algas ou plantas de folhas finas como Elodea) usando microscopia ^leve1. Estudar o movimento do cloroplasto na maioria das folhas, no entanto, requer um pré-tratamento para induzir o movimento do cloroplasto, fixação química e preparação de seções transversais antes de visualizar as amostras sob um microscópio ^leve10. Com a introdução da microscopia a laser confocal, também tornou-se possível a imagem do arranjo 3D de cloroplastos em folhas intactas ou fixas4,11,12. Essas técnicas de imagem auxiliam muito a compreensão do movimento do cloroplasto, fornecendo informações qualitativas importantes. Quantificar o posicionamento de cloroplasto (por exemplo, como uma porcentagem de cloroplastos nas posições periclínicas ou anticlinais nestas imagens ou a porcentagem de área coberta por cloroplastos por superfície celular total) também é possível, mas bastante demorado, especialmente se realizado nos intervalos necessários para capturar mudanças rápidas no ^{posicionamento10,8} . A maneira mais simples de mostrar se as folhas adaptadas escuras de uma determinada espécie ou mutantes são capazes de movimento de cloroplasto na resposta de evasão é cobrindo a maior parte da área de uma folha para manter os cloroplastos no escuro enquanto expõe uma tira da folha à luz alta. Após um mínimo de 20 minutos de alta exposição à luz, os cloroplastos na área exposta terão se movido para a posição de evasão, e a faixa exposta será visivelmente mais clara em cores do que o resto da folha. Isso é verdade para o tipo selvagem A. thaliana, mas não para alguns dos mutantes do movimento cloroplasto descritos com mais detalhes mais tarde em ¹³. Este método e modificações dele (por exemplo, invertendo quais partes da folha estão expostas, mudando a intensidade da luz) são úteis para a triagem de um grande número de mutantes e para identificar mutantes nulos que não têm a capacidade de exibir uma resposta de evasão ou acumulação ou ambos. No entanto, não fornece informações sobre as mudanças dinâmicas no movimento do cloroplasto.

Em contraste, o método aqui descrito permite a quantificação do movimento do cloroplasto em folhas intactas usando mudanças na transmissão de luz através de uma folha como proxy para o movimento global de cloroplasto: em condições em que cloroplastos são espalhados nas células de mesófila na resposta de acumulação, menos luz é transmitida através da folha do que quando muitos cloroplastos estão em resposta de evasão, posicionando-se ao longo das paredes celulares anti-cílicas. Assim, mudanças na transmissão podem ser usadas como proxy para o movimento global de cloroplasto nas ^folhas14. Os detalhes do instrumento são descritos em outros lugares (ver Arquivo Suplementar), mas basicamente, o instrumento usa luz azul para desencadear o movimento do cloroplasto e mede a quantidade de luz vermelha transmitida através dessa folha em intervalos definidos. Mais recentemente, foi descrita uma modificação deste sistema, que usa um leitor modificado de microplaca de 96 poços, um LED azul, um computador e uma incubadora controlada pela ^{temperatura15}.

A opção de utilizar uma combinação de métodos, incluindo a avaliação óptica das folhas para triagem, seguida pela medição de mudanças dinâmicas na transmissão e no uso da microscopia, tem ajudado muito a nossa compreensão tanto dos mecanismos subjacentes quanto da significância fisiológica/ecológica do movimento cloroplasto. Por exemplo, levou à descoberta e caracterização de vários mutantes, que são prejudicados em aspectos específicos de seus movimentos. Por exemplo, os mutantes A. thaliana phot 1 não têm a capacidade de acumular seus cloroplastos com pouca luz, enquanto os mutantes phot 2 não têm a capacidade de realizar uma reação de evasão. Esses fenótipos são devidos a um prejuízo em dois respectivos receptores de luz azul16,17,18. Em contraste, os mutantes chup1 não têm a capacidade de formar filamentos de actina adequados ao redor dos cloroplastos que são essenciais para mover os cloroplastos para a posição desejada dentro de uma ^célula11,19. Além de estudos mutantes, pesquisadores têm avaliado os efeitos de vários inibidores no movimento do cloroplasto para elucidar os aspectos mecanicistas do processo. Por exemplo, produtos químicos como _H2O2 e vários antioxidantes foram usados para investigar os efeitos desta molécula de sinalização no movimento do cloroplasto20. Vários inibidores foram usados para elucidar o papel do cálcio no movimento ^{cloroplasto21}. Além de ajudar a descobrir os mecanismos do movimento do cloroplasto, esses métodos podem ser usados para comparar o movimento do cloroplasto em várias espécies ou mutantes cultivados em diferentes condições na tentativa de entender o contexto ecológico e evolutivo desse comportamento. Por exemplo, foi demonstrado que a extensão dos efeitos de várias mutações na via de movimento do cloroplasto dependem das condições de ^{crescimento7,9}, e que as plantas adaptadas ao sol não parecem mover muito seus cloroplastos. Em contrapartida, o movimento é muito importante para as plantas de sombra10,22,23.

Este artigo de métodos, focado na planta modelo A. thaliana, descreve como usar um dispositivo de transmissão que é uma versão atualizada de um instrumento previamente ^{desenvolvido9}. Embora este instrumento não esteja disponível comercialmente, pessoas com uma compreensão básica da eletrônica ou da ajuda de colegas de engenharia ou física e estudantes poderão construir o instrumento usando peças acessíveis e seguindo as instruções detalhadas (ver Arquivo Suplementar). A plataforma de código aberto usada para construir o instrumento tem amplo suporte web e um fórum comunitário que oferece ajuda caso surjam ^problemas24.

O protocolo se concentra em como usar o instrumento para determinar mudanças na transmissão de folhas em uma execução exploratória padrão que expõe uma folha a uma ampla gama de condições de luz e captura as reações escuras, de acumulação e evasão de A. thaliana. Essas corridas podem ser modificadas dependendo do objetivo do experimento e podem ser usadas com a maioria das espécies vegetais. O artigo fornece exemplos de dados de transmissão de A. thaliana wildtype e vários mutantes e mostra como analisar melhor os dados.