La luce è essenziale per la fotosintesi, la crescita delle piante e lo sviluppo. È uno dei fattori abiotici più dinamici in quanto le intensità della luce non solo cambiano nel corso di una stagione o di un giorno, ma anche rapidamente e in modi imprevedibili a seconda della copertura nuvolosa. A livello fogliare, le intensità luminose sono influenzate anche dalla densità e dalla natura della vegetazione circostante e dalla chioma della pianta. Un meccanismo importante che consente alle piante di ottimizzare l’intercettazione della luce in condizioni di luce variabile è la capacità dei cloroplasti di muoversi in risposta agli stimoli della luce ^blu1,2. In condizioni di scarsa illuminazione, i cloroplasti si diffondono perpendicolarmente alla luce (lungo le pareti cellulari periclinali) in una cosiddetta risposta di accumulo, massimizzando l’intercettazione della luce e quindi la fotosintesi. In condizioni di luce intensa, i cloroplasti si muovono verso la parete cellulare anticlinale in una cosiddetta risposta di evitamento, riducendo al minimo l’intercettazione della luce e il pericolo di fotoinibizione. In molte specie, i cloroplasti assumono anche una specifica posizione scura, che è distinta dalle posizioni di accumulo ed evitamento e spesso intermedia tra queste ^due3,4. Vari studi hanno dimostrato che il movimento dei cloroplasti non è importante solo per la tolleranza allo stress a breve termine delle ^foglie5,6,7, ma anche per la crescita e il successo riproduttivo delle piante, specialmente in condizioni di luce ^variabile8,9.

Il movimento del cloroplasto è facilmente osservabile in tempo reale in alcuni esemplari vivi (ad esempio, alghe o piante a foglia sottile come Elodea) utilizzando la microscopia ^ottica1. Lo studio del movimento del cloroplasto nella maggior parte delle foglie, tuttavia, richiede un pretrattamento per indurre il movimento del cloroplasto, la fissazione chimica e la preparazione delle sezioni trasversali prima di visualizzare i campioni al microscopio ^ottico10. Con l’introduzione della microscopia laser confocale, è diventato anche possibile visualizzare la disposizione 3D dei cloroplasti in foglie intatte o fisse4,11,12. Queste tecniche di imaging aiutano notevolmente la comprensione del movimento del cloroplasto fornendo importanti informazioni qualitative. Quantificare il posizionamento dei cloroplasti (ad esempio, come percentuale di cloroplasti nelle posizioni periclinali o anticlinali in queste immagini o la percentuale di area coperta da cloroplasti per superficie cellulare totale) è anche possibile ma richiede molto tempo, soprattutto se condotto agli intervalli necessari per catturare rapidi cambiamenti di ^{posizionamento10,8} . Il modo più semplice per mostrare se le foglie scure adattate di una certa specie o mutanti sono in grado di muoversi con il cloroplasto nella risposta di evitamento è coprendo la maggior parte dell’area di una foglia per mantenere i cloroplasti al buio mentre espongono una striscia della foglia alla luce alta. Dopo un minimo di 20 minuti di esposizione alla luce elevata, i cloroplasti nell’area esposta si saranno spostati nella posizione di evitamento e la striscia esposta sarà visibilmente di colore più chiaro rispetto al resto della foglia. Questo è vero per il tipo selvatico A. thaliana ma non per alcuni dei mutanti del movimento dei cloroplasti descritti più dettagliatamente più ^avanti13. Questo metodo e le sue modifiche (ad esempio, invertire le parti della foglia esposte, cambiare l’intensità della luce) sono utili per lo screening di un gran numero di mutanti e per identificare mutanti nulli che non hanno la capacità di esibire una risposta di evitamento o accumulo o entrambi. Tuttavia, non fornisce informazioni sui cambiamenti dinamici nel movimento del cloroplasto.

Al contrario, il metodo qui descritto consente la quantificazione del movimento del cloroplasto nelle foglie intatte utilizzando i cambiamenti nella trasmissione della luce attraverso una foglia come proxy per il movimento complessivo del cloroplasto: in condizioni in cui i cloroplasti sono sparsi nelle cellule mesofilliche nella risposta di accumulo, meno luce viene trasmessa attraverso la foglia rispetto a quando molti cloroplasti sono in una risposta di evitamento, posizionandosi lungo le pareti cellulari anticlinali. Pertanto, i cambiamenti nella trasmissione possono essere utilizzati come proxy per il movimento complessivo del cloroplasto nelle ^foglie14. I dettagli dello strumento sono descritti altrove (vedi file supplementare), ma fondamentalmente, lo strumento utilizza la luce blu per innescare il movimento del cloroplasto e misura quanta luce rossa viene trasmessa attraverso quella foglia a intervalli prestabiliti. Più recentemente, è stata descritta una modifica di questo sistema, che utilizza un lettore di micropiastre a 96 pozzetti modificato, un LED blu, un computer e un incubatore a temperatura ^{controllata15}.

La possibilità di utilizzare una combinazione di metodi, tra cui la valutazione ottica delle foglie per lo screening, seguita dalla misurazione dei cambiamenti dinamici nella trasmissione e dall’uso della microscopia, ha notevolmente aiutato la nostra comprensione sia dei meccanismi sottostanti che del significato fisiologico / ecologico del movimento del cloroplasto. Ad esempio, ha portato alla scoperta e alla caratterizzazione di vari mutanti, che sono compromessi in aspetti specifici dei loro movimenti. Ad esempio, i mutanti di A. thaliana phot 1 non hanno la capacità di accumulare i loro cloroplasti in condizioni di scarsa illuminazione, mentre i mutanti phot 2 non hanno la capacità di eseguire una reazione di evitamento. Questi fenotipi sono dovuti a una compromissione di due rispettivi recettori della luce blu16,17,18. Al contrario, i mutanti chup1 non hanno la capacità di formare filamenti di actina adeguati attorno ai cloroplasti che sono essenziali per spostare i cloroplasti nella posizione desiderata all’interno di una ^cellula11,19. Oltre agli studi sui mutanti, i ricercatori hanno valutato gli effetti di vari inibitori sul movimento del cloroplasto per chiarire gli aspetti meccanicistici del processo. Ad esempio, sostanze chimiche come _H2O2 e vari antiossidanti sono stati utilizzati per studiare gli effetti di questa molecola di segnalazione sul movimento del cloroplasto20. Vari inibitori sono stati utilizzati per chiarire il ruolo del calcio nel movimento dei ^{cloroplasti21}. Oltre ad aiutare a scoprire i meccanismi del movimento dei cloroplasti, questi metodi possono essere utilizzati per confrontare il movimento del cloroplasto in varie specie o mutanti cresciuti in condizioni diverse nel tentativo di comprendere il contesto ecologico ed evolutivo di questo comportamento. Ad esempio, è stato dimostrato che l’entità degli effetti di varie mutazioni nella via di movimento del cloroplasto dipende dalle condizioni di ^crescita7,9 e che le piante adattate al sole non sembrano spostare molto i loro cloroplasti. Al contrario, il movimento è molto importante per le piante da ombra10,22,23.

Questo documento sui metodi, incentrato sull’impianto modello A. thaliana, descrive come utilizzare un dispositivo di trasmissione che è una versione aggiornata di uno strumento precedentemente ^sviluppato9. Mentre questo strumento non è disponibile in commercio, le persone con una conoscenza di base dell’elettronica o l’aiuto di colleghi e studenti di ingegneria o fisica saranno in grado di costruire lo strumento utilizzando parti a prezzi accessibili e seguendo le istruzioni dettagliate (vedi File supplementare). La piattaforma open source utilizzata per costruire lo strumento ha un ampio supporto web e un forum della comunità che offre aiuto in caso di ^problemi24.

Il protocollo si concentra su come utilizzare lo strumento per determinare i cambiamenti nella trasmissione fogliare in una corsa esplorativa standard che espone una foglia a una vasta gamma di condizioni di luce e cattura le reazioni scure, di accumulo ed evitamento di A. thaliana. Queste corse possono essere modificate a seconda dell’obiettivo dell’esperimento e possono essere utilizzate con la maggior parte delle specie vegetali. Il documento fornisce esempi di dati di trasmissione di A. thaliana wildtype e diversi mutanti e mostra come analizzare ulteriormente i dati.