Arabidopsis thaliana में क्लोरोप्लास्ट आंदोलन की जांच करने के लिए पत्ती संचरण में परिवर्तन का उपयोग करना
Summary
कई पौधों की प्रजातियां प्रकाश अवशोषण को अनुकूलित करने के लिए क्लोरोप्लास्ट की स्थिति को बदल देती हैं। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि प्रॉक्सी के रूप में एक पत्ती के माध्यम से प्रकाश के संचरण में परिवर्तन का उपयोग करके Arabidopsis thaliana पत्तियों में क्लोरोप्लास्ट आंदोलन की जांच करने के लिए एक सीधा, घर-निर्मित उपकरण का उपयोग कैसे किया जाए।
Abstract
पत्तियों में क्लोरोप्लास्ट आंदोलन को कुछ शर्तों के तहत फोटोइनहिबिशन को कम करने और विकास को बढ़ाने में मदद करने के लिए दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पत्तियों में क्लोरोप्लास्ट स्थिति का अध्ययन करके क्लोरोप्लास्ट आंदोलन के बारे में बहुत कुछ सीखा जा सकता है, लेकिन इस प्रकार की माइक्रोस्कोपी तक पहुंच सीमित है। यह प्रोटोकॉल एक ऐसी विधि का वर्णन करता है जो क्लोरोप्लास्ट आंदोलन के लिए प्रॉक्सी के रूप में पत्ती संचरण में परिवर्तन का उपयोग करता है। यदि प्रकाश अवरोधन को अधिकतम करने के लिए क्लोरोप्लास्ट को फैलाया जाता है, तो संचरण कम होगा। यदि क्लोरोप्लास्ट प्रकाश से बचने के लिए एंटीक्लिनल सेल की दीवारों की ओर बढ़ते हैं, तो संचरण अधिक होगा। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि पत्तियों को अलग-अलग नीली प्रकाश तीव्रता के लिए उजागर करने और पत्ती संचरण में गतिशील परिवर्तनों को मापने के लिए एक सीधा, घर-निर्मित उपकरण का उपयोग कैसे किया जाए। यह दृष्टिकोण शोधकर्ताओं को विभिन्न प्रजातियों और उत्परिवर्ती में क्लोरोप्लास्ट आंदोलन का मात्रात्मक रूप से वर्णन करने की अनुमति देता है, इस पर रसायनों और पर्यावरणीय कारकों के प्रभावों का अध्ययन करता है, या उपन्यास उत्परिवर्ती के लिए स्क्रीन उदाहरण के लिए, इस प्रक्रिया में लापता घटकों की पहचान करने के लिए जो प्रकाश धारणा से क्लोरोप्लास्ट के आंदोलन की ओर जाता है।
Introduction
प्रकाश संश्लेषण, पौधे की वृद्धि और विकास के लिए प्रकाश आवश्यक है। यह सबसे गतिशील अजैविक कारकों में से एक है क्योंकि प्रकाश तीव्रता न केवल एक मौसम या दिन के दौरान बदलती है, बल्कि बादल कवर के आधार पर तेजी से और अप्रत्याशित तरीकों से भी बदलती है। पत्ती के स्तर पर, प्रकाश तीव्रता भी आसपास की वनस्पति के घनत्व और प्रकृति और पौधे की अपनी चंदवा से प्रभावित होती है। एक महत्वपूर्ण तंत्र जो पौधों को चर प्रकाश परिस्थितियों के तहत प्रकाश अवरोधन को अनुकूलित करने की अनुमति देता है, वह है क्लोरोप्लास्ट की क्षमता नीली रोशनी उत्तेजनाओं के जवाब में स्थानांतरित करने के लिए 1,2। कम प्रकाश की स्थिति में, क्लोरोप्लास्ट एक तथाकथित संचय प्रतिक्रिया में प्रकाश (पेरिक्लिनल सेल की दीवारों के साथ) के लंबवत फैलते हैं, प्रकाश अवरोधन को अधिकतम करते हैं और इसलिए प्रकाश संश्लेषण करते हैं। उच्च प्रकाश की स्थिति में, क्लोरोप्लास्ट एक तथाकथित परिहार प्रतिक्रिया में एंटीक्लिनल सेल की दीवार की ओर बढ़ते हैं, जिससे प्रकाश अवरोधन और फोटोइनहिबिशन का खतरा कम हो जाता है। कई प्रजातियों में, क्लोरोप्लास्ट भी एक विशिष्ट अंधेरे स्थिति को मानते हैं, जो संचय और परिहार की स्थिति से अलग है और अक्सर उन दो3,4 के बीच मध्यस्थ होता है। विभिन्न अध्ययनों से पता चला है कि क्लोरोप्लास्ट आंदोलन न केवल पत्तियों 5,6,7 की अल्पकालिक तनाव सहिष्णुता के लिए महत्वपूर्ण है, बल्कि पौधों के विकास और प्रजनन सफलता के लिए भी महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से चर प्रकाश परिस्थितियों में 8,9।
क्लोरोप्लास्ट आंदोलन को प्रकाश माइक्रोस्कोपी 1 का उपयोग करके कुछ जीवित नमूनों (जैसे, शैवाल या एलोडिया जैसे पतले पत्ते वाले पौधों) में वास्तविक समय में आसानी से देखा जाता है। अधिकांश पत्तियों में क्लोरोप्लास्ट आंदोलन का अध्ययन करना, हालांकि, क्लोरोप्लास्ट आंदोलन, रासायनिक निर्धारण, और प्रकाश माइक्रोस्कोप 10 के तहत नमूनों को देखने से पहले क्रॉस सेक्शन की तैयारी को प्रेरित करने के लिए एक pretreatment की आवश्यकता होती है। कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोपी की शुरुआत के साथ, बरकरार या निश्चित पत्तियों में क्लोरोप्लास्ट की 3 डी व्यवस्था की छवि बनाना भी संभव हो गया4,11,12। ये इमेजिंग तकनीकें महत्वपूर्ण गुणात्मक जानकारी प्रदान करके क्लोरोप्लास्ट आंदोलन की समझ में बहुत सहायता करती हैं। क्लोरोप्लास्ट पोजिशनिंग (उदाहरण के लिए, इन छवियों में पेरिक्लिनल या एंटीक्लिनल पदों में क्लोरोप्लास्ट के प्रतिशत के रूप में या कुल सेल सतह पर क्लोरोप्लास्ट द्वारा कवर किए गए क्षेत्र का प्रतिशत) को परिमाणित करना भी संभव है, लेकिन काफी समय लेने वाला है, खासकर यदि स्थिति में तेजी से परिवर्तन को पकड़ने के लिए आवश्यक अंतराल पर आयोजित किया जाता है10,8 . यह दिखाने का सबसे आसान तरीका है कि क्या एक निश्चित प्रजाति या उत्परिवर्ती की अंधेरे-अनुकूलित पत्तियां परिहार प्रतिक्रिया में क्लोरोप्लास्ट आंदोलन में सक्षम हैं, एक पत्ती के अधिकांश क्षेत्र को कवर करना है ताकि पत्ती की एक पट्टी को उच्च प्रकाश में उजागर करते हुए क्लोरोप्लास्ट को अंधेरे में रखा जा सके। उच्च प्रकाश जोखिम के कम से कम 20 मिनट के बाद, उजागर क्षेत्र में क्लोरोप्लास्ट परिहार स्थिति में चले गए होंगे, और उजागर पट्टी पत्ती के बाकी हिस्सों की तुलना में रंग में स्पष्ट रूप से हल्की होगी। यह जंगली प्रकार ए थालियाना के लिए सच है, लेकिन बाद में 13 पर अधिक विस्तार से वर्णित क्लोरोप्लास्ट आंदोलन उत्परिवर्ती में से कुछ के लिए नहीं। यह विधि और इसके संशोधन (उदाहरण के लिए, पत्ती के किन हिस्सों को उजागर किया जाता है, प्रकाश तीव्रता को बदलने के लिए उलटना) बड़ी संख्या में उत्परिवर्ती की स्क्रीनिंग के लिए और नल म्यूटेंट की पहचान करने के लिए उपयोगी हैं जिनमें या तो परिहार या संचय प्रतिक्रिया या दोनों को प्रदर्शित करने की क्षमता की कमी होती है। हालांकि, यह क्लोरोप्लास्ट आंदोलन में गतिशील परिवर्तनों के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है।
इसके विपरीत, यहां वर्णित विधि समग्र क्लोरोप्लास्ट आंदोलन के लिए प्रॉक्सी के रूप में एक पत्ती के माध्यम से प्रकाश संचरण में परिवर्तन का उपयोग करके बरकरार पत्तियों में क्लोरोप्लास्ट आंदोलन के परिमाणीकरण की अनुमति देती है: उन परिस्थितियों में जब संचय प्रतिक्रिया में मेसोफिल कोशिकाओं में क्लोरोप्लास्ट फैलाए जाते हैं, तो पत्ती के माध्यम से कम प्रकाश प्रसारित होता है जब कई क्लोरोप्लास्ट परिहार प्रतिक्रिया में होते हैं, एंटीक्लिनल सेल दीवारों के साथ खुद को स्थिति। इसलिए, संचरण में परिवर्तन का उपयोग पत्तियों में समग्र क्लोरोप्लास्ट आंदोलन के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जा सकता है14। उपकरण के विवरण को कहीं और वर्णित किया गया है ( अनुपूरक फ़ाइल देखें), लेकिन मूल रूप से, उपकरण क्लोरोप्लास्ट आंदोलन को ट्रिगर करने के लिए नीली रोशनी का उपयोग करता है और मापता है कि निर्धारित अंतराल पर उस पत्ते के माध्यम से कितनी लाल रोशनी प्रसारित होती है। हाल ही में, इस प्रणाली के एक संशोधन का वर्णन किया गया है, जो एक संशोधित 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट रीडर, एक नीले एलईडी, एक कंप्यूटर और एक तापमान-नियंत्रित इनक्यूबेटर 15 का उपयोग करता है।
स्क्रीनिंग के लिए पत्तियों के ऑप्टिकल मूल्यांकन सहित विधियों के संयोजन का उपयोग करने का विकल्प, संचरण में गतिशील परिवर्तनों को मापने और माइक्रोस्कोपी के उपयोग के बाद, अंतर्निहित तंत्र और क्लोरोप्लास्ट आंदोलन के शारीरिक / पारिस्थितिक महत्व दोनों की हमारी समझ में बहुत सहायता की है। उदाहरण के लिए, इसने विभिन्न उत्परिवर्ती की खोज और लक्षण वर्णन का नेतृत्व किया, जो उनके आंदोलनों के विशिष्ट पहलुओं में बिगड़ा हुआ है। उदाहरण के लिए, ए थालियाना फोट 1 म्यूटेंट में कम रोशनी में अपने क्लोरोप्लास्ट को जमा करने की क्षमता की कमी होती है, जबकि फोट 2 म्यूटेंट में परिहार प्रतिक्रिया करने की क्षमता की कमी होती है। ये फेनोटाइप दो संबंधित नीले प्रकाश रिसेप्टर्स 16,17,18 में एक हानि के कारण होते हैं। इसके विपरीत, chup1 उत्परिवर्ती में क्लोरोप्लास्ट के चारों ओर उचित एक्टिन फिलामेंट्स बनाने की क्षमता की कमी होती है जो क्लोरोप्लास्ट को सेल 11,19 के भीतर वांछित स्थिति में स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक हैं। उत्परिवर्ती अध्ययनों के अलावा, शोधकर्ताओं ने प्रक्रिया के यांत्रिक पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए क्लोरोप्लास्ट आंदोलन पर विभिन्न अवरोधकों के प्रभावों का आकलन किया है। उदाहरण के लिए, H2O2 और विभिन्न एंटीऑक्सिडेंट जैसे रसायनों का उपयोग क्लोरोप्लास्ट आंदोलन 20 पर इस सिग्नलिंग अणु के प्रभावों की जांच करने के लिए किया गया था। क्लोरोप्लास्ट आंदोलन 21 में कैल्शियम की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए विभिन्न अवरोधकों का उपयोग किया गया था। क्लोरोप्लास्ट आंदोलन के तंत्र को उजागर करने में मदद करने के अलावा, इन तरीकों का उपयोग इस व्यवहार के पारिस्थितिक और विकासवादी संदर्भ को समझने के प्रयास में विभिन्न प्रजातियों या विभिन्न स्थितियों में उगाए गए उत्परिवर्ती में क्लोरोप्लास्ट आंदोलन की तुलना करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि क्लोरोप्लास्ट आंदोलन मार्ग में विभिन्न उत्परिवर्तनों के प्रभावों की सीमा विकास की स्थिति 7,9 पर निर्भर करती है, और यह कि सूर्य-अनुकूलित पौधे अपने क्लोरोप्लास्ट को बहुत अधिक स्थानांतरित नहीं करते हैं। इसके विपरीत, छाया पौधों के लिए आंदोलन बहुत महत्वपूर्ण है10,22,23।
यह विधियाँ कागज, मॉडल संयंत्र ए थालियाना पर केंद्रित है, यह वर्णन करता है कि एक ट्रांसमिशन डिवाइस का उपयोग कैसे किया जाए जो पहले से विकसित इंस्ट्रूमेंट 9 का एक अद्यतन संस्करण है। हालांकि यह उपकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, इलेक्ट्रॉनिक्स की बुनियादी समझ वाले लोग या इंजीनियरिंग या भौतिकी के सहयोगियों और छात्रों की मदद से सस्ती भागों का उपयोग करके और विस्तृत निर्देशों का पालन करके उपकरण का निर्माण करने में सक्षम होंगे ( पूरक फ़ाइल देखें)। उपकरण बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले ओपन-सोर्स प्लेटफ़ॉर्म में व्यापक वेब समर्थन और एक सामुदायिक मंच है जो मदद प्रदान करता है, समस्याएं उत्पन्न होनी चाहिए24।
प्रोटोकॉल इस बात पर ध्यान केंद्रित करता है कि एक मानक अन्वेषक रन में पत्ती संचरण में परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए उपकरण का उपयोग कैसे किया जाए जो एक पत्ती को प्रकाश की स्थिति की एक विस्तृत श्रृंखला में उजागर करता है और ए थालियाना के अंधेरे, संचय और परिहार प्रतिक्रियाओं को कैप्चर करता है। इन रनों को प्रयोग के लक्ष्य के आधार पर संशोधित किया जा सकता है और अधिकांश पौधों की प्रजातियों के साथ उपयोग किया जा सकता है। पेपर ए थालियाना वाइल्डटाइप और कई म्यूटेंट के ट्रांसमिशन डेटा के उदाहरण प्रदान करता है और दिखाता है कि डेटा का आगे विश्लेषण कैसे किया जाए।
Protocol
Representative Results
Discussion
डिवाइस का उपयोग करना बेहद आसान है, लेकिन ट्रांसमिशन डिवाइस के प्रत्येक लीफ क्लिप सेट-अप को स्वतंत्र रूप से कैलिब्रेट करना महत्वपूर्ण है क्योंकि एलईडी और फोटोट्रांजिस्टर की स्थिति पत्ती क्लिप से लीफ ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वित्त पोषण एक फिस्के पुरस्कार और एक वेलेस्ले कॉलेज संकाय पुरस्कार द्वारा प्रदान किया गया था।
Materials
| Aluminum foil | |||
| Dark adapted leaves | |||
| Filter paper | |||
| iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info) | |||
| Pipette | Any | ||
| Petri dish | Any | ||
| Transmission device (see Supplemental info) | |||
| Water |
Referências
- Senn, G. . Die Gestalts- und Lageveränderung der Pflanzenchromatophoren. , (1908).
- Zurzycki, J. The influence of chloroplast displacements on the optical properties of leaves. Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 30, 503-527 (1961).
- Wada, M., Kagawa, T., Sato, Y. Chloroplast movement. Annual Review of Plant Biology. 54, 455-468 (2003).
- Wada, M. Chloroplast movement. Plant Science. 210, 177-182 (2013).
- Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., Suetsugu, N., Miyao, M., Wada, M. Chloroplast avoidance movement reduces photodamage in plants. Nature. 420, 829-832 (2002).
- Davis, P. A., Hangarter, R. P. Chloroplast movement provides photoprotection to plants by redistributing PSII damage within leaves. Photosynthesis Research. 112, 153-161 (2012).
- Howard, M. M., Bae, A., Königer, M. The importance of chloroplast movement, nonphotochemical quenching, and electron transport rates in light acclimation and tolerance to high light in Arabidopsis thaliana. American Journal of Botany. 106 (11), 1-10 (2019).
- Gotoh, E., et al. Chloroplast accumulation response enhances leaf photosynthesis and plant biomass production. Plant Physiology. 178, 1358-1369 (2018).
- Howard, M. M., Bae, A., Pirani, Z., Van, N., Königer, M. Impairment of chloroplast movement reduces growth and delays reproduction of Arabidopsis thaliana in natural and controlled conditions. American Journal of Botany. 107 (9), 1309-1318 (2020).
- Trojan, A., Gabryś, H. Chloroplast distribution in Arabidopsis thaliana (L.) depends on light conditions during growth. Plant Physiology. 111, 419-425 (1996).
- Oikawa, K., et al. Chloroplast unusual positioning is essential for proper chloroplast positioning. The Plant Cell. 15, 2805-2815 (2003).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Kagawa, T., et al. Arabidopsis NPL1: a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response. Science. 291, 2138-2141 (2001).
- Berg, R., et al. A simple low-cost microcontroller-based photometric instrument for monitoring chloroplast movement. Photosynthesis Research. 87, 303-311 (2006).
- Johansson, H., Zeidler, M. Automatic chloroplast movement analysis. Biologia Molecular. 1398, 29-35 (2016).
- Briggs, W. R., et al. The phototropin family of photoreceptors. Plant Cell. 13, 993-997 (2001).
- Jarillo, J. A., et al. Phototropin-related NPL1 controls chloroplast relocation induced by blue light. Nature. 410, 952-954 (2001).
- Sakai, T. Arabidopsis nph1 and npl1: blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 98 (12), 6969-6974 (2001).
- Wada, M., Kong, S. -. G. Actin-mediated movement of chloroplasts. Journal of Cell Science. 131, 1-8 (2018).
- Wen, F., Xing, D., Zhang, L. Hydrogen peroxide is involved in high blue light-induced chloroplast avoidance movements in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 59 (10), 2891-2901 (2008).
- Tlalka, M., Fricker, M. The role of calcium in blue-light dependent chloroplast movement in Lemna trisulca L. The Plant Journal. 20, 461-473 (1999).
- Königer, M., Bollinger, N. Chloroplast movement behavior varies widely among species and does not correlate with high light stress tolerance. Planta. 236, 411-426 (2012).
- Higa, T., Wada, M. Chloroplast avoidance movement is not functional in plants grown under strong sunlight. Plant, Cell and Environment. 39, 871-882 (2016).
- . Arduino.cc Available from: https://www.arduino.cc (2021)
- Königer, M., Delamaide, J. A., Marlow, E. D., Harris, G. C. thaliana leaves with altered chloroplast numbers and chloroplast movement exhibit impaired adjustments to both low and high light. Journal of Experimental Botany. 59, 2285-2297 (2008).
