Lys er afgørende for fotosyntese, plantevækst og udvikling. Det er en af de mest dynamiske abiotiske faktorer, da lysintensiteter ikke kun ændrer sig i løbet af en sæson eller dag, men også hurtigt og på uforudsigelige måder afhængigt af skydækket. På bladniveau påvirkes lysintensiteterne også af tætheden og arten af den omgivende vegetation og plantens egen baldakin. En vigtig mekanisme, der gør det muligt for planter at optimere lys aflytning under variable lysforhold er kloroplasternes evne til at bevæge sig som reaktion på blåt lys ^stimuli1,2. Under svagt lys spredes kloroplaster vinkelret på lyset (langs de vinkelrette cellevægge) i en såkaldt akkumuleringsrespons, hvilket maksimerer lysaflytning og dermed fotosyntese. Under høje lysforhold bevæger kloroplaster sig mod anticlinalcellevæggen i et såkaldt undgåelsesrespons, hvilket minimerer lysaflytning og faren for fotoinhibition. I mange arter antager kloroplaster også en bestemt mørk position, som adskiller sig fra akkumulerings- og undgåelsespositionerne og ofte mellemled mellem disse ^to3,4. Forskellige undersøgelser har vist, at chloroplast bevægelse er ikke kun vigtigt for den kortsigtede stress tolerance af ^blade5,6,7, men også for vækst og reproduktiv succes af planter, især under variable ^{lysforhold8,9}.

Chloroplast bevægelse er let observeret i realtid i visse levende prøver (f.eks alger eller tyndtbladede planter som Elodea) ved hjælp af lys mikroskopi1. Undersøgelse af chloroplast bevægelse i de fleste blade, dog kræver en forbehandling for at fremkalde chloroplast bevægelse, kemisk fiksering, og forberedelse af tværsnit, før du ser prøverne under et ^{lysmikroskop10}. Med indførelsen af konfokal lasermikroskopi blev det også muligt at afbilde 3D-arrangementet af kloroplaster i intakte eller faste blade4,11,12. Disse billeddannelsesteknikker hjælper i høj grad forståelsen af chloroplastbevægelser ved at give vigtige kvalitative oplysninger. Kvantificering af chloroplastpositionering (f.eks. i procent af chloroplaster i periclinale eller anticlinale positioner på disse billeder eller procentdelen af området dækket af chloroplast pr. samlet celleoverflade) er også mulig, men ganske tidskrævende, især hvis den udføres med de intervaller, der er nødvendige for at opfange hurtige ændringer i ^{positionering10,8} . Den enkleste måde at vise, om mørktilpassede blade af en bestemt art eller mutanter er i stand til chloroplast bevægelse i undgåelse svar er ved at dække det meste af området af et blad for at holde chloroplasts i mørke og samtidig udsætte en strimmel af bladet til højt lys. Efter mindst 20 min høj lyseksponering vil kloroplasterne i det udsatte område være flyttet ind i undgåelsespositionen, og den udsatte strimmel vil være synligt lysere i farven end resten af bladet. Dette gælder for vilde type A. thaliana, men ikke for nogle af de chloroplast bevægelse mutanter beskrevet mere detaljeret ^senere13. Denne metode og modifikationer af det (f.eks vende, hvilke dele af bladet er udsat, skiftende lysintensiteter) er nyttige til screening af et stort antal mutanter og til at identificere null mutanter, der mangler enten evnen til at udvise en undgåelse eller akkumulering svar eller begge dele. Det giver dog ikke oplysninger om de dynamiske ændringer i chloroplast bevægelse.

I modsætning hertil giver den metode, der er beskrevet her, mulighed for kvantificering af chloroplastbevægelser i intakte blade ved hjælp af ændringer i lystransmission gennem et blad som proxy for samlet chloroplastbevægelse: under forhold, hvor kloroplaster spredes ud i mesophyllcellerne i akkumuleringsresponset, overføres der mindre lys gennem bladet, end når mange kloroplaster er i undgåelsesrespons, positionering sig langs anticlinal celle vægge. Derfor kan ændringer i transmission bruges som proxy for den samlede chloroplast bevægelse i ^blade14. Detaljerne i instrumentet er beskrevet andetsteds (se supplerende fil), men dybest set, instrumentet bruger blåt lys til at udløse chloroplast bevægelse og måler, hvor meget rødt lys overføres gennem dette blad med faste intervaller. For nylig er en ændring af dette system blevet beskrevet, som bruger en modificeret 96-brønd mikropladelæser, en blå LED, en computer og en temperaturstyret ^inkubator15.

Muligheden for at anvende en kombination af metoder, herunder optisk vurdering af blade til screening, efterfulgt af måling af dynamiske ændringer i transmission og brug af mikroskopi, har i høj grad hjulpet vores forståelse af både de underliggende mekanismer og den fysiologiske / økologiske betydning af chloroplast bevægelse. For eksempel førte det til opdagelse og karakterisering af forskellige mutanter, som er nedsat i specifikke aspekter af deres bevægelser. For eksempel mangler A. thaliana phot 1 mutanter evnen til at akkumulere deres kloroplaster i svagt lys, mens phot 2 mutanter mangler evnen til at udføre en undgåelsesreaktion. Disse fænotyper skyldes en svækkelse i to respektive blå lys receptorer16,17,18. I modsætning hertil mangler chup1 mutanter evnen til at danne ordentlige aktinstråde omkring kloroplasterne, som er afgørende for at flytte kloroplasterne i den ønskede position i en ^celle11,19. Ud over mutante undersøgelser har forskere vurderet forskellige hæmmeres virkninger på kloroplastbevægelser for at belyse de mekanistiske aspekter af processen. For eksempel blev kemikalier som _H2O2 og forskellige antioxidanter brugt til at undersøge virkningerne af dette signalmolekyle på chloroplast ^bevægelse20. Forskellige hæmmere blev brugt til at belyse calciums rolle i chloroplast ^bevægelse21. Ud over at hjælpe med at afdække mekanismerne i chloroplast bevægelse, kan disse metoder bruges til at sammenligne chloroplast bevægelse i forskellige arter eller mutanter dyrket under forskellige forhold i et forsøg på at forstå den økologiske og evolutionære sammenhæng af denne adfærd. For eksempel har det vist sig, at omfanget af virkningerne af forskellige mutationer i chloroplast bevægelsesvejen er afhængig af ^{vækstbetingelserne7,9}, og at soltilpassede planter ikke synes at flytte deres kloroplaster meget. I modsætning hertil er bevægelse meget vigtigt for skyggeplanter10,22,23.

Denne metode papir, fokuseret på model anlægget A. thaliana, beskriver, hvordan man bruger en transmissionsanordning, som er en opdateret version af en tidligere udviklet ^instrument9. Mens dette instrument ikke er kommercielt tilgængeligt, vil folk med en grundlæggende forståelse af elektronik eller hjælp fra ingeniør- eller fysikkolleger og studerende være i stand til at bygge instrumentet ved hjælp af overkommelige dele og følge de detaljerede instruktioner (se supplerende fil). Open source-platformen, der bruges til at opbygge instrumentet, har omfattende websupport og et fællesskabsforum, der tilbyder hjælp, hvis der opstår ^problemer24.

Protokollen fokuserer på, hvordan man bruger instrumentet til at bestemme ændringer i bladtransmission i en standard sonderende køre, der udsætter et blad til en bred vifte af lysforhold og indfanger den mørke, ophobning, og undgåelse reaktioner A. thaliana. Disse kørsler kan ændres afhængigt af eksperimentets mål og kan bruges med de fleste plantearter. Papiret giver eksempler på transmissionsdata af A. thaliana wildtype og flere mutanter og viser, hvordan man yderligere analyserer dataene.