Medindo a evolução temporal de materiais em nanoescala com espalhamento de nêutrons de fluxo interrompido e de pequeno ângulo

O espalhamento de nêutrons a baixo ângulo (SANS) fornece uma maneira única de medir os tamanhos, formas, interações e organização de vários materiais em escalas de comprimento de ≈1 nm a ≈100 nm ^1,2,3. Instrumentos recentes, incluindo instrumentos VSANS (very small-angle neutron scattering) com espelhos de focalização, ultrapassam os limites para medir escalas de comprimento ainda maiores de até ≈1000 nm ^4,5. Em geral, o contraste de espalhamento único inerente aos métodos de espalhamento de nêutrons oferece várias vantagens na mensuração do tempo de evolução de estruturas nanométricas, tais como a agregação de componentes em formulações farmacêuticas⁶, reações de reticulação e gelificação em sistemas poliméricos^7,8, na mesocristalização de proteínas de membrana^9,10, degradação e desdobramento de proteínas^11,12 e crescimento de materiais à base de sílica^13,14,15. O contraste de dispersão exclusivo torna o SANS (TR-SANS) resolvido no tempo um complemento útil para outras medições baseadas em fluxo parado.

Métodos de mistura de fluxo interrompido são frequentemente implementados em espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS)16,17,18,19,20,21, espectroscopia de fluorescência 22,23,24,25,26 e espalhamento de luz^{27,28,29,30, 31,32} experimentos para estudar processos cinéticos em escalas de tempo de milissegundos. Uma diferença importante entre SANS e SAXS é que o espalhamento de nêutrons é uma técnica de caracterização não destrutiva e, como tal, o SANS pode ser usado para medir a mesma amostra por horas ou até dias sem danos de radiação ionizante na amostra, o que pode acontecer durante experimentos de espalhamento de raios X de alto fluxo³³. Como medidas repetidas de SANS não alteram a estrutura química da molécula ou amostra da sonda, a evolução temporal pode ser estudada sem efeitos do fotoclareamento, por exemplo, o que pode complicar medidas cinéticas que dependem de fluorescência^23,24. Além disso, o SANS pode ser usado para medir amostras altamente concentradas e opticamente opacas que muitas vezes são difíceis de caracterizar com técnicas baseadas em luz, como espalhamento dinâmico de luz.

Além de fornecer informações estruturais sobre a nanoescala, o SANS pode ser usado para sondar a composição local dessas estruturas através da variação no contraste de densidade de comprimento de espalhamento de nêutrons. A densidade de comprimento de espalhamento (SLD) de diferentes elementos varia aleatoriamente ao longo da tabela periódica e varia com diferentes isótopos do mesmo elemento. Um exemplo comumente explorado é o hidrogênio (¹H ou H) e o deutério (²H ou D), que têm comprimentos de espalhamento de nêutrons muito diferentes. Portanto, materiais ricos em hidrogênio, como surfactantes, lipídios, proteínas, RNA, DNA e outros polímeros, podem ser distinguidos dos solventes deuterados usando SANS sem alterar significativamente as propriedades físicas do sistema. No entanto, é importante notar que a troca H/D pode afetar a densidade, a ligação de hidrogênio e as temperaturas de transição de fase na amostra. No entanto, a sensibilidade única do SANS a materiais ricos em hidrogênio é especialmente útil em pesquisas de matéria mole, onde as amostras de interesse têm menor espalhamento, contraste e sinal em técnicas baseadas em raios-X, como o SAXS. A substituição isotópica também torna o SANS uma ferramenta poderosa para estudar a cinética de troca molecular em materiais ricos em hidrogênio simplesmente misturando moléculas marcadas com H e D. A substituição isotópica é particularmente útil em sistemas onde corantes fluorescentes volumosos são maiores que o surfactante ou moléculas lipídicas de interesse e podem influenciar a cinética de troca^34,35.

As medições SANS resolvidas no tempo são vantajosas porque a intensidade medida é função do tempo, da escala de comprimento e do contraste SLD. Como tal, os experimentos TR-SANS podem ser projetados para investigar as mudanças dependentes do tempo nas distribuições espaciais e nas composições das amostras. Essas vantagens únicas do SANS levaram a importantes insights sobre processos cinéticos em muitos sistemas de materiais moles, como surfactantes 36,37,38, emulsões 39,40,41, lipídios 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ^,50, e polímeros 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. A maioria dos estudos TR-SANS tem se concentrado em escalas de tempo de minutos a horas. No entanto, muitos processos cinéticos de interesse ocorrem na segunda escala de tempo e são essenciais para a compreensão dos mecanismos subjacentes. A captura desses primeiros pontos de tempo requer que as soluções sejam rapidamente misturadas e medidas in situ, nas quais a mistura é sincronizada com a coleta de dados durante o espalhamento de luz de fluxo interrompido 27,28,29,30,31,32, fluorescência ^{22,23,24,25,26} e raios X 16,17,18,19,20,21 experimentos. Este trabalho descreve o uso de um ambiente de amostra projetado para misturar rapidamente várias amostras líquidas e injetar a mistura em uma célula de vidro de quartzo para medições de TR-SANS. O dispositivo de mistura é uma adaptação do dispositivo reoSANS capilar⁶³ recentemente desenvolvido e usa várias bombas de seringa e válvulas para controlar a mistura de amostras e automatizar a limpeza das células. Ao conectar bombas de seringa a uma série de válvulas seletoras de fluxo, vários fluxos de entrada podem ser repetidamente misturados, medidos, enxaguados e secos para facilitar as medições TR-SANS na escala de tempo de segundos.

O procedimento atual pressupõe que as amostras de interesse tenham sido identificadas e preparadas. Nós nos concentramos na configuração de mistura in situ e nos métodos para coletar dados TR-SANS. Os dados de espalhamento de nêutrons foram coletados no instrumento VSANS no NIST Center for Neutron Research (NCNR); no entanto, o procedimento deve ser aplicável a outros instrumentos SANS. Os leitores interessados em implementar protocolos semelhantes em outros instrumentos SANS devem consultar os cientistas locais do instrumento para determinar a configuração ideal do instrumento para maximizar o fluxo de nêutrons na escala de comprimento e tempo desejadas mais relevantes para os processos cinéticos de interesse. Os dados aqui apresentados foram coletados usando a configuração de feixe branco de alto fluxo em VSANS para maximizar a contagem de nêutrons na perda de resolução espacial⁵. Os carruagens dos detectores foram posicionados de modo a cobrir uma faixa de vetores de espalhamento (q), 0,005 Å-1 < q < 0,5 ^Å-1, correspondendo a escalas de comprimento de ≈130 nm a ≈13 nm. O vetor de espalhamento é definido como q = 4π/λ pecado (θ/2) em que λ é o comprimento de onda de nêutrons, e θ é o ângulo de espalhamento.

O dispositivo de mistura de fluxo parado usado para as medições TR-SANS consiste em várias bombas, seringas de enxágue, seringas de amostra, seletores de fluxo, bem como misturador adinâmico, célula de amostra e recipiente de amostra mista, como mostrado na Figura 1. Todos os caminhos de fluido selados estão localizados dentro de um gabinete com ar condicionado, que inclui seringas, válvulas, tubos de conexão, misturador dinâmico e células de amostra. Um ar condicionado termoelétrico programável é usado para controlar a temperatura do gabinete na faixa de 10 °C a 50 °C dentro de ±1 °C. Observe que parte do isolamento do gabinete foi removido para mostrar as partes de trabalho do dispositivo. O gabinete do dispositivo de mistura principal é posicionado em um estágio de translação na linha de luz NG3 VSANS no NCNR. A posição do compartimento é ajustada usando o estágio de translação para posicionar a célula de amostra no caminho do feixe de nêutrons (linha tracejada amarela).

Figura 1: Um exemplo de configuração para combinar medições de mistura de fluxo interrompido e espalhamento de nêutrons de pequeno ângulo na linha de luz VSANS no NIST Center for Neutron Research. A configuração contém quatro bombas de seringa, duas seringas para enxágue com solvente e duas seringas para injeção de amostra, quatro válvulas seletoras de bomba, duas válvulas seletoras de misturador, um misturador dinâmico, uma célula de quartzo de fluxo e um recipiente de amostra mista. Os nêutrons incidentes se espalham pela amostra mista localizada dentro da célula da amostra. Um gabinete isolado com janelas de quartzo e uma unidade termoelétrica de ar condicionado é usado para controlar a amostra e todos os equipamentos a uma temperatura constante. A linha tracejada amarela mostra o caminho do feixe de nêutrons. Barra de escala = 10 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O dispositivo representado na Figura 1 é configurado com duas seringas de amostra, duas seringas de enxágue e uma célula de amostra. Os fluxogramas correspondentes para as diferentes etapas do protocolo estão ilustrados na Figura 2. Os volumes desejados das duas amostras diferentes são injetados no misturador e na célula da amostra (Figura 2A). Uma vez que a célula de amostra é preenchida, a válvula de comutador de entrada (ISV) e a válvula de comutador de saída (OSV) são fechadas para isolar a célula de amostra do misturador dinâmico e evitar a retrodifusão da amostra na célula durante a coleta de dados do TR-SANS (Figura 2B). Antes do misturador dinâmico, a tubulação de conexão varia em comprimento de 10 cm a 1 m e não afeta o tempo de atraso de mistura. No entanto, as conexões de tubulação entre o misturador dinâmico e a célula de amostra afetarão o tempo de atraso de mistura e o volume de injeção de amostra necessário. Tubos pré-cortados de aço inoxidável com diâmetro interno de 0,04 polegadas (1 mm) e 100 mm de comprimento são usados para conectar o misturador dinâmico, as válvulas seletoras do misturador (MSV1 e MSV2) e o ISV e OSV. Tubos fluorados com 1 mm de diâmetro interno e 115 mm de comprimento são usados para conectar o ISV e o OSV (ou a saída dinâmica do misturador) à célula da amostra. O volume total de micção que influencia o tempo de atraso de mistura inclui o volume de micção do misturador (0,15 mL), a tubulação entre a saída do misturador e a entrada da célula de amostra (0,09 mL) e o volume da célula de amostra (0,16 mL). Neste exemplo, o volume total da micção é de 0,4 mL. Os volumes de vazios internos das válvulas são insignificantes em comparação com os volumes de vazio de tubulação, misturador e célula de amostra. Por exemplo, as válvulas seletoras de baixa pressão empregadas (diâmetro do furo de 0,75 mm) contêm volumes de vazio aproximados de 4 μL, enquanto as válvulas seletoras de alta pressão e válvulas de comutação (diâmetro do furo de 0,25 mm) contêm volumes de vazio aproximados de 0,5 μL.

Após a conclusão da medição do TR-SANS, a amostra é empurrada para fora da célula com solvente, e o solvente de enxágue é bombeado repetidamente através da célula para remover a amostra residual e limpar a célula da amostra (Figura 2C). Observe que as seringas de enxágue são conectadas a reservatórios de solvente maiores (por exemplo, água e etanol) por meio de valores de seletor de bomba para garantir que volumes adequados de solvente estejam disponíveis para limpar a célula de amostra entre as execuções de medição. Fontes de solventes, fontes de amostras e recipientes de amostras mistas que contêm líquidos inflamáveis são posicionados em um compartimento separado sem equipamento elétrico para eliminar todas as possíveis fontes de ignição. Além disso, tampas de garrafas com bloqueio de vapor são usadas para minimizar vapores inflamáveis e evaporação de solventes. Finalmente, a célula da amostra é seca com uma corrente de gás nitrogênio para remover o solvente de enxágue residual (Figura 2D). A pressão de entrada do gás nitrogênio para a válvula seletora do misturador é regulada para aproximadamente 2 bar (0,2 MPa, pressão manométrica) usando um regulador de pressão manual localizado no cilindro de gás nitrogênio. Uma vez que a célula de amostra esteja suficientemente limpa e seca, uma nova amostra misturada é injetada na célula de amostra para o próximo ciclo de medição (repetindo a mistura e a injeção ilustradas no diagrama de fluxo na Figura 2A).

Figura 2: Exemplo de diagrama de fluxo usando uma célula de amostra, duas amostras misturando e dois solventes de enxágue para limpeza . (A) Mistura da amostra A (azul) e da amostra B (vermelho) e, em seguida, fluir a amostra mista (roxa) para a célula da amostra. (B) Durante a coleta de dados, o dispositivo de fluxo interrompido indica onde as válvulas de comutação ISV e OSV são fechadas para isolar a célula da amostra e impedir a retrodifusão da amostra durante a coleta de dados. (C) As etapas de limpeza em que a célula da amostra é lavada com solvente de enxágue de SS1 (verde) após a coleta de dados. (D) Etapa de secagem em que a célula da amostra é seca com gás nitrogênio (laranja). Abreviações: PSV = válvula seletora da bomba; MSV = válvula seletora misturadora; OSV = válvula de interruptor de saída; ISV = válvula de comutador de entrada; SS1 = fonte de solvente 1; SSA = fonte de amostra A; N2 = fonte de gás nitrogênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3 mostra diagramas de fluxo para uma versão ligeiramente diferente, na qual a configuração de mistura é configurada com duas células de amostra separadas conectadas às mesmas válvulas de comutação (Figura 3A). Enquanto os dados do TR-SANS são coletados na célula de amostra 1, a célula de amostra 2 é lavada (Figura 3B) e seca (Figura 3C). Quando a coleta de dados é concluída para a Célula de Amostra 1, a Válvula do Interruptor de Entrada direciona uma amostra recém-misturada para a Célula de Amostra 2 para a coleta de dados (Figura 3D). Enquanto os dados do TR-SANS são coletados na célula de amostra 2, a célula de amostra 1 é lavada e seca (Figura 3E). Este processo alternado e paralelo entre duas células de amostra minimiza o tempo entre as injeções subsequentes da amostra e maximiza o uso do tempo do feixe de nêutrons.

Figura 3: Exemplo de diagrama de fluxo usando duas células de amostra, duas amostras misturando e dois solventes de enxágue para limpeza. (A) Misturar a amostra A (azul) e a amostra B (vermelho) e, em seguida, fluir a amostra mista (roxa) para a célula 1 da amostra. (B) O estado do dispositivo de fluxo interrompido durante a coleta de dados na célula de amostra 1, enquanto a célula de amostra 2 é lavada com solvente de SS1 (verde). (C) O estado do dispositivo de fluxo interrompido durante a coleta de dados na célula de amostra 1, enquanto a célula de amostra 2 é seca com gás nitrogênio (laranja). (D) Uma vez concluída a coleta de dados da célula 1 da amostra, uma nova amostra (roxa) é imediatamente misturada e fluída para a célula 2 da amostra. (E) O estado do dispositivo de fluxo interrompido durante a coleta de dados na célula de amostra 2, enquanto a célula de amostra 1 é lavada com solvente de SS1 (verde). Enquanto uma célula de amostra está sendo medida, a outra célula de amostra está sendo limpa e seca. O processo de medição de fluxo interrompido alterna entre duas células de amostra para minimizar o tempo entre as injeções subsequentes de mistura de amostras. Abreviações: PSV = válvula seletora da bomba; MSV = válvula seletora misturadora; OSV = válvula de interruptor de saída; ISV = válvula de comutador de entrada; SS1 = fonte de solvente 1; SSA = fonte de amostra A; N2 = fonte de gás nitrogênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um protocolo passo a passo é descrito abaixo para conectar as bombas e linhas de tubulação, preparar o sistema, enxaguar e secar a célula da amostra e injetar a amostra mista. Embora a configuração de célula única seja demonstrada pela simplicidade (Figura 2), a configuração modular flexível, o protocolo e os scripts podem ser facilmente modificados para implementar mais bombas de seringa, válvulas, misturadores ou configurações de célula de amostra, como a configuração de célula de duas amostras mostrada na Figura 3. Dados representativos da taxa bruta de contagem de nêutrons coletados ao longo dos ciclos de injeção de mistura e limpeza são mostrados na Figura 4, enquanto a cinética de troca lipídica medida em 3 temperaturas diferentes e a intensidade dispersa normalizada extraída correspondente à fração de lipídios trocados são mostrados na Figura 5 e na Figura 6, respectivamente.