Nano Ölçekli Malzemelerin Zaman-Evrimini Durdurulmuş Akış ve Küçük Açılı Nötron Saçılması ile Ölçme

Küçük açılı nötron saçılması (SANS), çeşitli malzemelerin boyutlarını, şekillerini, etkileşimlerini ve organizasyonlarını ≈1 nm ila ≈100 nm ^1,2,3 arasındaki uzunluk ölçeklerinde ölçmek için benzersiz bir yol sağlar. Odaklama aynalı VSANS (çok küçük açılı nötron saçılımı) cihazları da dahil olmak üzere yeni cihazlar, ≈1000 nm ^4,5’e kadar daha büyük uzunluktaki ölçekleri ölçmeye yönelik sınırları zorlamaktadır. Genel olarak, nötron saçılma yöntemlerine özgü benzersiz saçılma kontrastı, farmasötik formülasyonlardaki bileşenlerin toplanması⁶, polimer sistemlerde çapraz bağlanma ve jelasyon reaksiyonları^7,8, membran proteinlerinin mezo kristalizasyonunda ^9,10, proteinlerin parçalanması ve açılması^11,12 gibi nano ölçekli yapıların zaman evrimini ölçmede çeşitli avantajlar sunar ve silika bazlı malzemelerin büyümesi^13,14,15. Benzersiz saçılma kontrastı, zaman çözümlü SANS’I (TR-SANS) diğer durdurulmuş akış tabanlı ölçümler için kullanışlı bir tamamlayıcı haline getirir.

Durdurulmuş akışlı karıştırma yöntemleri genellikle küçük açılı X-ışını saçılması (SAXS)16,17,18,19,20,21, floresan spektroskopisi 22,23,24,25,26 ve ışık saçılması ^27,28,29,30, Kinetik süreçleri milisaniye zaman ölçeklerinde incelemek için ^31,32 deney. SANS ve SAXS arasındaki önemli bir fark, nötron saçılmasının tahribatsız bir karakterizasyon tekniği olmasıdır ve bu nedenle, SANS, aynı numuneyi, numuneye iyonlaştırıcı radyasyon hasarı vermeden saatlerce hatta günlerce ölçmek için kullanılabilir; bu, daha yüksek akılı X-ışını saçılma deneyleri sırasında meydana gelebilir³³. Tekrarlanan SANS ölçümleri prob molekülünün veya numunenin kimyasal yapısını değiştirmeyeceğinden, zaman evrimi, örneğin floresan^23,24’e dayanan kinetik ölçümleri zorlaştırabilecek fotobeyazlatmanın etkileri olmadan incelenebilir. Dahası, SANS, dinamik ışık saçılması gibi ışığa dayalı tekniklerle karakterize edilmesi genellikle zor olan yüksek konsantrasyonlu ve optik olarak opak numuneleri ölçmek için kullanılabilir.

Nano ölçekte yapısal bilgi sağlamanın yanı sıra, SANS, nötron saçılma uzunluğu yoğunluk kontrastındaki varyasyon yoluyla bu yapıların yerel bileşimini araştırmak için kullanılabilir. Farklı elementlerin saçılma uzunluğu yoğunluğu (SLD) periyodik tablo boyunca rastgele değişir ve aynı elementin farklı izotoplarına göre değişir. Yaygın olarak kullanılan bir örnek, çok farklı nötron saçılma uzunluklarına sahip olan hidrojen (¹H veya H) ve döteryumdur (²H veya D). Bu nedenle, yüzey aktif maddeler, lipitler, proteinler, RNA, DNA ve diğer polimerler gibi hidrojen bakımından zengin malzemeler, sistemin fiziksel özelliklerini önemli ölçüde değiştirmeden SANS kullanılarak deuterated çözücülerden ayırt edilebilir. Bununla birlikte, H / D değişiminin numunedeki yoğunluğu, hidrojen bağını ve faz geçiş sıcaklıklarını etkileyebileceğini belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, SANS’ın hidrojen bakımından zengin malzemelere karşı benzersiz duyarlılığı, özellikle ilgilenilen numunelerin SAXS gibi X-ışını tabanlı tekniklerde daha düşük saçılma kontrastına ve sinyaline sahip olduğu yumuşak madde araştırmalarında yararlıdır. İzotopik ikame aynı zamanda SANS’ı, H etiketli ve D etiketli molekülleri karıştırarak hidrojen bakımından zengin malzemelerdeki moleküler değişim kinetiği incelemek için güçlü bir araç haline getirir. İzotopik ikame, hacimli floresan boyaların ilgilenilen yüzey aktif madde veya lipit moleküllerinden daha büyük olduğu ve değişim kinetiğini etkileyebileceği sistemlerde özellikle yararlıdır^34,35.

Zaman çözümlü SANS ölçümleri avantajlıdır çünkü ölçülen yoğunluk zaman, uzunluk ölçeği ve SLD kontrastının bir fonksiyonudur. Bu nedenle, TR-SANS deneyleri, mekansal dağılımlardaki ve örneklerin kompozisyonlarındaki zamana bağlı değişiklikleri araştırmak için tasarlanabilir. SANS’ın bu benzersiz avantajları, yüzey aktif maddeler 36,37,38, emülsiyonlar^39,40,41, lipitler 34,42,43,44,45,46,47,48,49 gibi birçok yumuşak malzeme sisteminde kinetik süreçler hakkında önemli bilgiler edinmiştir ^,50 ve polimerler 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. TR-SANS çalışmalarının çoğu, dakikalar ila saatler arasındaki zaman ölçeklerine odaklanmıştır. Bununla birlikte, ilgilenilen birçok kinetik süreç ikinci zaman ölçeğinde meydana gelir ve altta yatan mekanizmaları anlamak için gereklidir. Bu erken zaman noktalarının yakalanması, çözeltilerin hızlı bir şekilde karıştırılmasını ve yerinde ölçülmesini gerektirir; burada karıştırma, durdurulmuş akışlı ışık saçılması 27,28,29,30,31,32, floresan ^{22,23,24,25,26} ve X-ışını ^{sırasında veri toplama ile senkronize edilir} 16,17,18,19,20,21 deney. Bu çalışma, TR-SANS ölçümleri için birden fazla sıvı numuneyi hızlı bir şekilde karıştırmak ve karışımı bir kuvars cam hücresine enjekte etmek için tasarlanmış bir numune ortamının kullanımını açıklamaktadır. Karıştırma cihazı, yakın zamanda geliştirilen kılcal reoSANS cihazı^63’ün bir uyarlamasıdır ve numune karıştırmayı kontrol etmek ve hücre temizliğini otomatikleştirmek için birden fazla şırınga pompası ve valfi kullanır. Şırınga pompalarını bir dizi akış seçici vanaya bağlayarak, TR-SANS ölçümlerini saniye zaman ölçeğinde kolaylaştırmak için birden fazla giriş akışı tekrar tekrar karıştırılabilir, ölçülebilir, durulanabilir ve kurutulabilir.

Mevcut prosedür, ilgilenilen örneklerin tanımlandığını ve hazırlandığını varsaymaktadır. TR-SANS verilerini toplamak için yerinde karıştırma kurulumuna ve yöntemlerine odaklanıyoruz. Nötron saçılma verileri, NIST Nötron Araştırma Merkezi’ndeki (NCNR) VSANS cihazında toplandı; ancak, prosedür diğer SANS cihazlarına uygulanabilir olmalıdır. Benzer protokolleri diğer SANS cihazlarına uygulamak isteyen okuyucular, ilgilenilen kinetik süreçlerle en alakalı istenen uzunluk ölçeğinde ve zaman ölçeğinde nötron akısını en üst düzeye çıkarmak için en uygun cihaz konfigürasyonunu belirlemek için yerel cihaz bilim insanlarına danışmalıdır. Burada sunulan veriler, uzamsal çözünürlük⁵ kaybında nötron sayımlarını en üst düzeye çıkarmak için VSANS üzerindeki yüksek akı ‘beyaz ışın’ konfigürasyonu kullanılarak toplanmıştır. Dedektör taşıyıcıları, ≈130 nm ila ≈13 nm uzunluk ölçeklerine karşılık gelen 0,005 Å-1 < q < 0,5 ^Å-1 aralığındaki bir dizi saçılma vektörünü (q) kapsayacak şekilde konumlandırılmıştır. Saçılma vektörü, q = 4π / λ günah (θ / 2) olarak tanımlanır; burada λ, nötron dalga boyu ve θ, saçılma açısıdır.

TR-SANS ölçümleri için kullanılan durdurulmuş akışlı karıştırma cihazı, Şekil 1’de görüldüğü gibi birden fazla pompa, durulama şırıngası, numune şırıngası, akış seçicilerin yanı sıra adinamik karıştırıcı, numune hücresi ve karışık numune kabından oluşmaktadır. Tüm sızdırmaz sıvı yolları, şırıngaları, vanaları, bağlantı borularını, dinamik karıştırıcıyı ve numune hücrelerini içeren klimalı bir muhafazanın içine yerleştirilmiştir. Muhafaza sıcaklığını ±1 °C içinde 10 °C ila 50 °C aralığında kontrol etmek için programlanabilir bir termoelektrik klima kullanılır. Cihazın çalışan parçalarını göstermek için muhafaza yalıtımının bir kısmının kaldırıldığını unutmayın. Ana karıştırma cihazı muhafazası, NCNR’deki NG3 VSANS ışın hattındaki bir çeviri aşamasına yerleştirilmiştir. Muhafaza konumu, numune hücresini nötron ışınının yoluna (sarı kesikli çizgi) yerleştirmek için çeviri aşaması kullanılarak ayarlanır.

Şekil 1: NIST Nötron Araştırma Merkezi’ndeki VSANS ışın hattında durdurulmuş akışlı karıştırma ve küçük açılı nötron saçılma ölçümlerini birleştirmek için örnek bir kurulum. Kurulumda dört şırınga pompası, solvent durulama için iki şırınga ve numune enjeksiyonu için iki şırınga, dört pompa seçici valf, iki karıştırıcı seçici valf, bir dinamik karıştırıcı, bir akışlı kuvars hücresi ve bir karışık numune kabı bulunur. Gelen nötronlar, numune hücresinin içinde bulunan karışık numuneyi saçar. Kuvars pencereli yalıtımlı bir muhafaza ve termoelektrik klimalı bir ünite, numuneyi ve tüm ekipmanı sabit bir sıcaklıkta kontrol etmek için kullanılır. Sarı kesikli çizgi nötron ışını yolunu gösterir. Ölçek çubuğu = 10 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 1’de gösterilen cihaz, iki numune şırıngası, iki durulama şırıngası ve bir numune hücresi ile yapılandırılmıştır. Protokolün farklı adımları için karşılık gelen akış diyagramları Şekil 2’de gösterilmiştir. İki farklı numunenin istenilen hacimleri miksere ve numune hücresine enjekte edilir (Şekil 2A). Numune hücresi doldurulduktan sonra, numune hücresini dinamik karıştırıcıdan izole etmek ve TR-SANS veri toplama sırasında numunenin hücreye geri difüzyonunu önlemek için Giriş Anahtar Vanası (ISV) ve Çıkış Anahtar Vanası (OSV) kapatılır (Şekil 2B). Dinamik karıştırıcıdan önce, bağlantı borusunun uzunluğu 10 cm ila 1 m arasında değişir ve karıştırma gecikme süresini etkilemez. Bununla birlikte, dinamik karıştırıcı ile numune hücresi arasındaki boru bağlantıları, karıştırma gecikme süresini ve gerekli numune enjeksiyon hacmini etkileyecektir. Dinamik karıştırıcıyı, Mikser Seçici Vanaları (MSV1 ve MSV2) ve ISV ve OSV’yi bağlamak için 0,04 inç (1 mm) iç çapa ve 100 mm uzunluğa sahip önceden kesilmiş paslanmaz çelik borular kullanılır. ISV ve OSV’yi (veya dinamik karıştırıcı çıkışını) numune hücresine bağlamak için 1 mm iç çapa ve 115 mm uzunluğa sahip florlu boru kullanılır. Karıştırma gecikme süresini etkileyen toplam boşluk hacmi, mikser boşluk hacmini (0,15 mL), karıştırıcı çıkışı ile numune hücresi girişi arasındaki boruyu (0,09 mL) ve numune hücresi hacmini (0,16 mL) içerir. Bu örnekte, toplam boşluk hacmi 0,4 mL’dir. Vanaların iç boşluk hacimleri, boru, karıştırıcı ve numune hücresi boşluk hacimlerine kıyasla ihmal edilebilir. Örneğin, kullanılan düşük basınçlı seçici valfler (0,75 mm delik çapı) yaklaşık 4 μL’lik boşluk hacimleri içerirken, yüksek basınçlı seçici valfler ve anahtar valfleri (0,25 mm delik çapı) yaklaşık 0,5 μL’lik boşluk hacimleri içerir.

TR-SANS ölçümü tamamlandıktan sonra, numune çözücü ile hücre dışına itilir ve artık numuneyi çıkarmak ve numune hücresini temizlemek için durulama çözücüsü hücre içinden tekrar tekrar pompalanır (Şekil 2C). Durulama şırıngalarının, ölçüm çalışmaları arasında numune hücresini temizlemek için yeterli çözücü hacminin mevcut olduğundan emin olmak için pompa seçici değerleri aracılığıyla daha büyük çözücü rezervuarlarına (örn. su ve etanol) bağlandığını unutmayın. Solvent kaynakları, numune kaynakları ve yanıcı sıvılar içeren karışık numune kapları, olası tüm ateşleme kaynaklarını ortadan kaldırmak için elektrikli ekipman içermeyen ayrı bir muhafazaya yerleştirilir. Ek olarak, yanıcı buharları ve çözücü buharlaşmasını en aza indirmek için buhar kilitlemeli şişe kapakları kullanılır. Son olarak, artık durulama çözücüsünü uzaklaştırmak için numune hücresi bir azot gazı akışı ile kurutulur (Şekil 2D). Karıştırıcı seçici vanasına giriş azot gazı basıncı, azot gazı silindiri üzerinde bulunan manuel bir basınç regülatörü kullanılarak yaklaşık 2 bar’a (0,2 MPa, gösterge basıncı) ayarlanır. Numune hücresi yeterince temizlendikten ve kurutulduktan sonra, bir sonraki ölçüm döngüsü için numune hücresine yeni karıştırılmış bir numune enjekte edilir ( Şekil 2A’daki akış diyagramında gösterilen karıştırma ve enjeksiyonu tekrarlayarak).

Şekil 2: Bir numune hücresi, iki numune karıştırma ve temizlik için iki durulama çözücüsü kullanan örnek akış diyagramı . (A) Numune A (mavi) ve numune B’nin (kırmızı) karıştırılması ve daha sonra karıştırılan numunenin (mor) numune hücresine akıtılması. (B) Veri toplama sırasında, numune hücresini izole etmek ve veri toplama sırasında numunenin geri yayılmasını önlemek için ISV ve OSV anahtar valflerinin kapatıldığı durdurulmuş akışlı cihaz durumu. (C) Veri toplandıktan sonra numune hücresinin SS1’den (yeşil) durulama çözücüsü ile durulandığı temizleme adımları. (D) Numune hücresinin azot gazı (turuncu) ile kurutulduğu kurutma adımı. Kısaltmalar: PSV = pompa seçici valf; MSV = mikser seçici vana; OSV = çıkış anahtar valfi; ISV = giriş anahtarı valfi; SS1 = çözücü kaynağı 1; SSA = örnek kaynak A; N2 = azot gazı kaynağı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3, karıştırma kurulumunun aynı şalt vanalarına bağlı iki ayrı numune hücresiyle yapılandırıldığı biraz farklı bir versiyon için akış diyagramlarını göstermektedir (Şekil 3A). TR-SANS verileri Örnek Hücre 1’de toplanırken, Örnek Hücre 2 durulanır (Şekil 3B) ve kurutulur (Şekil 3C). Örnek Hücre 1 için veri toplama tamamlandığında, Giriş Anahtar Vanası yeni karıştırılmış bir numuneyi veri toplama için Örnek Hücre 2’ye yönlendirir (Şekil 3D). TR-SANS verileri Örnek Hücre 2’de toplanırken, Örnek Hücre 1 durulanır ve kurutulur (Şekil 3E). İki numune hücresi arasındaki bu alternatif, paralel işlem, sonraki numune enjeksiyonları arasındaki süreyi en aza indirir ve nötron ışını zamanının kullanımını en üst düzeye çıkarır.

Şekil 3: İki numuneli hücre, iki numune karıştırma ve temizlik için iki durulama çözücüsü kullanan örnek akış diyagramı. (A) Numune A (mavi) ve numune B’nin (kırmızı) karıştırılması ve daha sonra karıştırılan numunenin (mor) numune hücre 1’e akıtılması. (B) Numune hücresi 2, SS1’den (yeşil) çözücü ile durulanırken, numune hücresi 1’de veri toplama sırasında durdurulan akış cihazı durumu. (C) Numune hücresi 1’de veri toplanması sırasında durdurulan akış cihazı durumu, numune hücresi 2 ise azot gazı (turuncu) ile kurutulur. (D) Örnek hücre 1’in veri toplanması tamamlandıktan sonra, yeni bir numune (mor) derhal karıştırılır ve numune hücresi 2’ye akar. (E) Numune hücresi 1, SS1’den (yeşil) çözücü ile durulanırken, numune hücresi 2’de veri toplama sırasında durdurulan akış cihazı durumu. Bir örnek hücre ölçülürken, diğer örnek hücre temizlenir ve kurutulur. Durdurulmuş akış ölçüm prosesi, sonraki numune karıştırma enjeksiyonları arasındaki süreyi en aza indirmek için iki numune hücresi arasında geçiş yapar. Kısaltmalar: PSV = pompa seçici valf; MSV = mikser seçici vana; OSV = çıkış anahtar valfi; ISV = giriş anahtarı valfi; SS1 = çözücü kaynağı 1; SSA = örnek kaynak A; N2 = azot gazı kaynağı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Pompaların ve boru hatlarının bağlanması, sistemin astarlanması, numune hücresinin durulanması ve kurutulması ve karışık numunenin enjekte edilmesi için adım adım bir protokol aşağıda açıklanmıştır. Tek hücreli konfigürasyon basitlik için gösterilse de (Şekil 2), esnek modüler kurulum, protokol ve komut dosyaları, Şekil 3’te gösterilen iki örnekli hücre konfigürasyonu gibi daha fazla şırınga pompası, vana, karıştırıcı veya numune hücre konfigürasyonu uygulamak için kolayca değiştirilebilir. Karıştırma ve temizleme enjeksiyon döngüleri boyunca toplanan temsili ham nötron sayım oranı verileri Şekil 4’te gösterilirken, 3 farklı sıcaklıkta ölçülen lipit değişim kinetiği ve değiştirilen lipitlerin fraksiyonuna karşılık gelen ekstrakte edilmiş normalize dağılmış yoğunluk sırasıyla Şekil 5 ve Şekil 6’da gösterilmiştir.