מדידת התפתחות הזמן של חומרים ננומטריים באמצעות זרימה עצורה ופיזור נייטרונים בזווית קטנה

פיזור נייטרונים בזווית קטנה (SANS) מספק דרך ייחודית למדוד את הגדלים, הצורות, האינטראקציות והארגון של חומרים שונים בסקאלות אורך מ-≈1 ננומטר עד ≈100 ננומטר ^1,2,3. מכשירים עדכניים, כולל מכשירי VSANS (פיזור נייטרונים בזווית קטנה מאוד) עם מראות ממוקדות, מותחים את הגבולות לכיוון מדידת סקאלות אורך גדולות עוד יותר עד ≈1000 ננומטר ^4,5. באופן כללי, ניגודיות הפיזור הייחודית הטבועה בשיטות פיזור נייטרונים מציעה מספר יתרונות במדידת התפתחות הזמן של מבנים ננומטריים, כגון צבירת רכיבים בפורמולציות פרמצבטיות⁶, תגובות הצלבה וג’לציה במערכות פולימריות ^7,8, בהתגבשות מזו של חלבוני ממברנה^9,10, פירוק והתפתחות חלבונים^11,12 וגידול חומרים מבוססי סיליקה^13,14,15.^, ניגודיות הפיזור הייחודית הופכת את SANS (TR-SANS) לפתרון הזמן כהשלמה שימושית למדידות אחרות המבוססות על זרימה עצורה.

שיטות ערבוב זרימה עצורה מיושמות לעתים קרובות בפיזור קרני רנטגן בזווית קטנה (SAXS)16,17,18,19,20,21, ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית 22,23,24,25,26, ופיזור אור ^{27,28,29,30, 31,32} ניסויים לחקר תהליכים קינטיים בסקאלות הזמן של אלפיות השנייה. הבדל חשוב בין SANS ל-SAXS הוא שפיזור נייטרונים הוא טכניקת אפיון לא הרסנית, וככזו, ניתן להשתמש ב-SANS כדי למדוד את אותה דגימה במשך שעות או אפילו ימים ללא נזקי קרינה מייננת לדגימה, מה שיכול לקרות במהלך ניסויי פיזור קרני רנטגן בשטף גבוה יותר³³. מכיוון שמדידות SANS חוזרות ונשנות לא ישנו את המבנה הכימי של מולקולת הגשושית או הדגימה, ניתן לחקור את התפתחות הזמן ללא השפעות של הלבנה, למשל, מה שיכול לסבך מדידות קינטיקה המסתמכות על פלואורסצנטיות^23,24. יתר על כן, ניתן להשתמש ב-SANS כדי למדוד דגימות מרוכזות מאוד ואטומות אופטית שלעתים קרובות קשה לאפיין באמצעות טכניקות מבוססות אור כגון פיזור אור דינמי.

בנוסף לאספקת מידע מבני בקנה מידה ננומטרי, SANS יכול לשמש כדי לחקור את ההרכב המקומי של מבנים אלה באמצעות השונות בניגודיות צפיפות אורך פיזור נייטרונים. צפיפות אורך הפיזור (SLD) של יסודות שונים משתנה באופן אקראי על פני הטבלה המחזורית ומשתנה עם איזוטופים שונים של אותו יסוד. דוגמה נפוצה היא מימן (¹H או H) ודאוטריום (²H או D), שיש להם אורכי פיזור נייטרונים שונים בתכלית. לכן, ניתן להבדיל בין חומרים עשירים במימן, כגון חומרים פעילי שטח, ליפידים, חלבונים, רנ”א, דנ”א ופולימרים אחרים, לבין ממיסים מפורקים באמצעות SANS מבלי לשנות באופן משמעותי את התכונות הפיזיקליות של המערכת. עם זאת, חשוב לציין כי חילופי H/D יכולים להשפיע על הצפיפות, קשרי המימן וטמפרטורות מעבר הפאזה בדגימה. עם זאת, הרגישות הייחודית של SANS לחומרים עשירים במימן שימושית במיוחד במחקר חומר רך, שבו הדגימות המעניינות הן בעלות ניגודיות פיזור ואות נמוכים יותר בטכניקות מבוססות קרני רנטגן כגון SAXS. החלפה איזוטופית גם הופכת את SANS לכלי רב עוצמה לחקר קינטיקה של חליפין מולקולרי בחומרים עשירים במימן פשוט על ידי ערבוב מולקולות המסומנות בתווית H ו-D. החלפה איזוטופית שימושית במיוחד במערכות שבהן צבעים פלואורסצנטיים מגושמים גדולים יותר ממולקולות פעילי השטח או השומנים המעניינות ויכולים להשפיע על קינטיקה של חליפין^34,35.

מדידות SANS שנפתרו בזמן הן יתרון מכיוון שהעוצמה הנמדדת היא פונקציה של זמן, סולם אורך וניגודיות SLD. לפיכך, ניסויי TR-SANS יכולים להיות מתוכננים לחקור את השינויים תלויי הזמן בהתפלגות המרחבית ובהרכב הדגימות. יתרונות ייחודיים אלה של SANS הובילו לתובנות חשובות לגבי תהליכים קינטיים במערכות רבות של חומרים רכים כגון חומרים פעילי שטח 36,37,38, תחליבים 39,40,41, ליפידים 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ^,50, ופולימרים 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. רוב מחקרי TR-SANS התמקדו בסקאלות זמן של דקות עד שעות. עם זאת, תהליכים קינטיים רבים של עניין מתרחשים בסולם הזמן השני והם חיוניים להבנת המנגנונים הבסיסיים. לכידת נקודות זמן מוקדמות אלה דורשת ערבוב מהיר של התמיסות ומדידה באתרן, כאשר הערבוב מסונכרן עם איסוף נתונים במהלך פיזור אור עצור זרימה 27,28,29,30,31,32, פלואורסצנטיות 22,23,24,25,26 ורנטגן 16,17,18,19,20,21 ניסויים. עבודה זו מתארת את השימוש בסביבת דגימה שנועדה לערבב במהירות דגימות נוזל מרובות ולהזריק את התערובת לתוך תא זכוכית קוורץ למדידות TR-SANS. מכשיר הערבוב הוא אדפטציה של מכשיר rheoSANS נימי^{שפותח לאחרונה 63} ומשתמש במספר משאבות מזרקים ושסתומים כדי לשלוט בערבוב הדגימות ולהפוך את ניקוי התאים לאוטומטי. על-ידי חיבור משאבות מזרקים לסדרה של שסתומי בורר זרימה, ניתן לערבב, למדוד, לשטוף ולייבש זרמי כניסה מרובים שוב ושוב כדי להקל על מדידות TR-SANS בסקאלת הזמן של השניות.

הנוהל הנוכחי מניח כי הדגימות המעניינות זוהו והוכנו. אנו מתמקדים בהגדרת ערבוב באתרו ובשיטות לאיסוף נתוני TR-SANS. נתוני פיזור נייטרונים נאספו במכשיר VSANS במרכז NIST לחקר נויטרונים (NCNR); עם זאת, ההליך צריך להיות ישים למכשירי SANS אחרים. קוראים המעוניינים ליישם פרוטוקולים דומים על מכשירי SANS אחרים צריכים להתייעץ עם מדעני המכשירים המקומיים כדי לקבוע את תצורת המכשירים האופטימלית כדי למקסם את שטף הנייטרונים בסקאלת האורך הרצויה ובסקאלת הזמן הרלוונטית ביותר לתהליכים הקינטיים המעניינים. הנתונים המוצגים כאן נאספו באמצעות תצורת “קרן לבנה” בשטף גבוה ב- VSANS כדי למקסם את ספירת הנייטרונים באובדן רזולוציה מרחבית⁵. קרונות הגלאי הוצבו כדי לכסות מגוון של וקטורי פיזור (q), 0.005 Å-1 < q < 0.5 ^Å-1, המתאימים לסקאלות אורך של ≈130 ננומטר עד ≈13 ננומטר. וקטור הפיזור מוגדר כ-q = 4π/λ sin (θ/2) כאשר λ הוא אורך גל הנייטרונים, ו-θ היא זווית הפיזור.

התקן ערבוב הזרימה המופסקת המשמש למדידות TR-SANS מורכב ממשאבות מרובות, מזרקי שטיפה, מזרקי דגימה, בוררי זרימה, כמו גם מיקסר דינמי, תא דגימה ומיכל דגימה מעורב, כפי שמוצג באיור 1. כל נתיבי הנוזל האטומים ממוקמים בתוך מארז ממוזג, הכולל את המזרקים, השסתומים, צינורות החיבור, המיקסר הדינמי ותאי הדגימה. מזגן תרמואלקטרי ניתן לתכנות משמש לשליטה על טמפרטורת המארז בטווח שבין 10 °C (75 °F) ל- 50 °C (75 °F) בתוך ± °C (75 °F). שים לב שחלק מבידוד המארז הוסר כדי להציג את חלקי העבודה של המכשיר. מארז התקן הערבוב הראשי ממוקם על במת תרגום בקו אלומת NG3 VSANS ב- NCNR. מיקום המארז מותאם באמצעות שלב התרגום כדי למקם את תא הדגימה בנתיב קרן הנייטרונים (קו מקווקו צהוב).

איור 1: מערך לדוגמה לשילוב של ערבוב זרימה עצורה ומדידות פיזור נייטרונים בזווית קטנה בקו הקרן VSANS במרכז NIST לחקר נייטרונים. ההתקנה כוללת ארבע משאבות מזרקים, שני מזרקים לשטיפת ממסים ושני מזרקים להזרקת דגימה, ארבעה שסתומי בורר משאבות, שני שסתומי בורר מיקסר, מיקסר דינמי, תא קוורץ זורם ומיכל דגימה מעורב. נייטרונים מקריים מתפזרים מהדגימה המעורבת הממוקמת בתוך תא הדגימה. מתחם מבודד עם חלונות קוורץ ויחידת מיזוג אוויר תרמואלקטרית משמש לשליטה על הדגימה וכל הציוד בטמפרטורה קבועה. הקו המקווקו הצהוב מראה את נתיב קרן הנייטרונים. סרגל קנה מידה = 10 ס”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ההתקן המתואר באיור 1 מוגדר עם שני מזרקים לדוגמה, שני מזרקי שטיפה ותא דגימה אחד. דיאגרמות זרימה תואמות עבור השלבים השונים של הפרוטוקול מודגמות באיור 2. הנפחים הרצויים של שתי הדגימות השונות מוזרקים למיקסר ולתא הדגימה (איור 2A). לאחר מילוי תא הדגימה, שסתום מתג הכניסה (ISV) ושסתום מתג היציאה (OSV) נסגרים כדי לבודד את תא הדגימה מהמערבל הדינמי ולמנוע דיפוזיה לאחור של הדגימה לתוך התא במהלך איסוף הנתונים TR-SANS (איור 2B). לפני המיקסר הדינמי, צינור החיבור משתנה באורכו בין 10 ס”מ ל-1 מ’ ואינו משפיע על זמן השהיית הערבוב. עם זאת, חיבורי צינורות בין המערבל הדינמי לתא הדגימה ישפיעו על זמן השהיית הערבוב ועל נפח הזרקת הדגימה הנדרש. צינורות נירוסטה חתוכים מראש בקוטר פנימי של 0.04 אינץ’ (1 מ”מ) ובאורך 100 מ”מ משמשים לחיבור המיקסר הדינמי, שסתומי בורר המיקסר (MSV1 ו- MSV2) וה- ISV וה- OSV. צינורות פלואור בקוטר פנימי של 1 מ”מ ובאורך 115 מ”מ משמשים לחיבור ספק התוכנה העצמאי (ISV) וה-OSV (או יציאת המיקסר הדינמי) לתא הדגימה. נפח החלל הכולל המשפיע על זמן השהיית הערבוב כולל את נפח חלל המיקסר (0.15 מ”ל), הצינור בין יציאת המיקסר לכניסת תא הדגימה (0.09 מ”ל) ונפח תא הדגימה (0.16 מ”ל). בדוגמה זו, נפח הריק הכולל הוא 0.4 מ”ל. נפחי החלל הפנימי של השסתומים זניחים בהשוואה לנפחי הצינורות, המיקסר ותאי הריק לדוגמה. לדוגמה, שסתומי בורר הלחץ הנמוך (קוטר בור 0.75 מ”מ) מכילים נפחי ריק משוערים של 4 מיקרוליטר, בעוד ששסתומי בורר הלחץ הגבוה ושסתומי המתג (קוטר בור 0.25 מ”מ) מכילים נפחי ריק משוערים של 0.5 מיקרוליטר.

לאחר השלמת המדידה של TR-SANS, הדגימה נדחפת החוצה מהתא באמצעות ממס, וממס השטיפה נשאב שוב ושוב דרך התא כדי להסיר את הדגימה השיורית ולנקות את תא הדגימה (איור 2C). שים לב שמזרקי השטיפה מחוברים למאגרי ממס גדולים יותר (למשל, מים ואתנול) באמצעות ערכי בורר משאבות כדי להבטיח נפחי ממס נאותים זמינים לניקוי תא הדגימה בין ריצות מדידה. מקורות ממס, מקורות דגימה ומיכלי דגימה מעורבים המכילים נוזלים דליקים ממוקמים במארז נפרד ללא ציוד חשמלי כדי לחסל את כל מקורות ההצתה האפשריים. בנוסף, פקקי בקבוקים ננעלים אדים משמשים כדי למזער אדים דליקים ואידוי ממס. לבסוף, תא הדגימה מיובש עם זרם גז חנקן כדי להסיר את שאריות ממס השטיפה (איור 2D). לחץ גז החנקן הנכנס לשסתום בורר המיקסר מווסת לכ -2 בר (0.2 מגפ”ס, לחץ מד) באמצעות וסת לחץ ידני הממוקם על בלון גז החנקן. לאחר שתא הדגימה מנוקה ומיובש מספיק, דגימה שזה עתה מעורבבת מוזרקת לתוך תא הדגימה עבור מחזור המדידה הבא (חזרה על הערבוב וההזרקה המודגמים בדיאגרמת הזרימה באיור 2A).

איור 2: דיאגרמת זרימה לדוגמה באמצעות תא דגימה אחד, ערבוב של שתי דוגמאות ושני ממיסי שטיפה לניקוי . (A) ערבוב של מדגם A (כחול) ומדגם B (אדום), ולאחר מכן הזרמת הדגימה המעורבת (סגול) לתוך תא הדגימה. (B) במהלך איסוף הנתונים, מצב התקן הזרימה המופסקת שבו שסתומי המתג ISV ו- OSV סגורים כדי לבודד את תא הדגימה ולמנוע דיפוזיה לאחור של הדגימה במהלך איסוף הנתונים. (C) שלבי הניקוי שבהם תא הדגימה נשטף בממס שטיפה מ-SS1 (ירוק) לאחר איסוף הנתונים. (D) שלב ייבוש שבו תא הדגימה מיובש בגז חנקן (כתום). קיצורים: PSV = שסתום בורר משאבות; MSV = שסתום בורר מיקסר; OSV = שסתום מתג שקע; ISV = שסתום מתג כניסה; SS1 = מקור ממס 1; SSA = מקור מדגם A; N2 = מקור גז חנקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3 מציג דיאגרמות זרימה עבור גרסה שונה במקצת שבה הגדרת הערבוב מוגדרת עם שני תאי דגימה נפרדים המחוברים לאותם שסתומי מתג (איור 3A). בעוד שנתוני TR-SANS נאספים בתא לדוגמה 1, תא דגימה 2 נשטף (איור 3B) ומיובש (איור 3C). לאחר השלמת איסוף הנתונים עבור תא לדוגמה 1, שסתום מתג הכניסה מפנה דגימה מעורבת חדשה לתוך תא מדגם 2 לצורך איסוף נתונים (איור 3D). בעוד שנתוני TR-SANS נאספים בתא לדוגמה 2, תא דגימה 1 נשטף ומיובש (איור 3E). תהליך מקביל לסירוגין זה בין שני תאי דגימה ממזער את הזמן בין הזרקות הדגימה הבאות וממקסם את השימוש בזמן קרן נויטרונים.

איור 3: דיאגרמת זרימה לדוגמה באמצעות תאים בני שתי דגימות, ערבוב של שתי דגימות ושני ממיסי שטיפה לניקוי. (A) ערבוב מדגם A (כחול) ומדגם B (אדום) ולאחר מכן הזרמת הדגימה המעורבת (סגול) לתא מדגם 1. (B) מצב התקן הזרימה המופסקת במהלך איסוף הנתונים בתא מדגם 1 בעוד תא מדגם 2 נשטף בממס מ-SS1 (ירוק). (C) מצב התקן הזרימה המופסקת במהלך איסוף הנתונים בתא מדגם 1 בעוד תא דגימה 2 מיובש בגז חנקן (כתום). (D) לאחר השלמת איסוף הנתונים של תא מדגם 1, מדגם חדש (סגול) מעורבב מיד ומוזרם לתא מדגם 2. (E) מצב התקן הזרימה המופסקת במהלך איסוף נתונים בתא מדגם 2 בעוד תא דגימה 1 נשטף בממס מ-SS1 (ירוק). בזמן שתא דגימה אחד נמדד, תא הדגימה השני מנוקה ומיובש. תהליך מדידת הזרימה המופסקת עובר לסירוגין בין שני תאי דגימה כדי למזער את הזמן בין זריקות ערבוב הדגימה הבאות. קיצורים: PSV = שסתום בורר משאבות; MSV = שסתום בורר מיקסר; OSV = שסתום מתג שקע; ISV = שסתום מתג כניסה; SS1 = מקור ממס 1; SSA = מקור מדגם A; N2 = מקור גז חנקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

להלן מתואר פרוטוקול שלב אחר שלב לחיבור המשאבות וקווי הצינורות, הכנת המערכת, שטיפה וייבוש תא הדגימה והזרקת הדגימה המעורבת. אף על פי שתצורת התא הבודד מודגמת בפשטות (איור 2), ניתן לשנות בקלות את ההגדרה, הפרוטוקול והסקריפטים המודולריים הגמישים כדי ליישם יותר משאבות מזרקים, שסתומים, מערבלים או תצורות תאים לדוגמה, כמו תצורת התא בן שתי הדגימות שמוצגת באיור 3. נתוני קצב ספירת נייטרונים גולמיים מייצגים שנאספו במהלך מחזורי הזרקת ערבוב וניקוי מוצגים באיור 4, בעוד שקינטיקה של חילופי שומנים שנמדדה ב-3 טמפרטורות שונות והעוצמה המפוזרת המנורמלת שחולצה המתאימה לחלק השומנים המוחלפים מוצגים באיור 5 ובאיור 6, בהתאמה.