Адаптация желудочно-кишечных органоидов к патогенной инфекции и секвенированию одиночных клеток в условиях уровня биобезопасности 3 (BSL-3)

Человеческая ткань была получена из резекции толстой кишки или биопсии подвздошной кишки из университетской клиники Гейдельберга по следующему протоколу. Данное исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Университетской клиники Гейдельберга с информированного письменного согласия всех испытуемых в соответствии с Хельсинкской декларацией. Все образцы были получены и сохранены в анонимной манере. Протокол был утвержден комиссией по этике университетской клиники Гейдельберга по протоколу S-443/2017. 1. Поддержание и пассаж органоидов кишечника и толстой кишки ВНИМАНИЕ: Органоиды кишечника человека получены из тканей человека или из индуцированных плюрипотентных / эмбриональных стволовых клеток, и поэтому требуется этическое одобрение. Необходимо соблюдать правила, касающиеся конкретных стран. Человеческий материал, как правило, не тестируется и поэтому часто считается материалом BSL-2. Надлежащие условия локализации должны быть подтверждены в стране, в которой проводится эксперимент. Получают органоиды кишечника и толстой кишки из изолированных тканей и/или биопсии с использованием ранее описанных способов2. Кроме того, более подробную техническую информацию о том, как получать органоиды из материала, полученного от пациента, или из iPSCs, можно найти в Lees et al. и Mahe et al.24,25. Как только органоидные культуры установлены, следуйте описанной ниже процедуре расщепления, чтобы подготовить органоиды для выполнения инфекций с кишечными патогенами. Семена 20-100 органоидов в 50 мкл 100% раствора ECM в 24-луночных нетканных обработанных культурой пластинах. Добавьте 500 мкл питательной среды(таблица 1)на лунку. Меняйте носитель каждые 2 дня, удаляя 250 мкл старой среды и добавляя 250 мкл свежих питательных сред в каждую лунку. Прогрейте среду до комнатной температуры перед заменой среды.ВНИМАНИЕ: Холодные среды будут разжижать раствор ECM, содержащий органоиды. Прохождение органоидов раз в неделю, когда внутренняя часть начинает темнеть из-за скопления отмерших клеток. Пример этого можно найти на рисунке 2. В день расщепления удалите раствор ECM от -20 °C и разморозьте на льду. Поместите новую пластину для посева пустых клеток, которая будет использоваться для посева органоидов после расщепления при 37 °C (для этого требуется минимум 1 час, чтобы быть теплым и может быть нагрета в течение ночи). Прогрейте питательные среды до комнатной температуры. Удалите питательную среду пипеткой P1000 и добавьте 500 мкл холодного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в каждую лунку в течение 3 мин, чтобы частично разжижать раствор ECM и диссоциировать от пластины. Чтобы обеспечить полное нарушение работы ECM-решения, используйте пипетку P1000 (установленную на 450 мкл). Пипетка вверх и вниз 10 раз, чтобы повторно суспендировать PBS, раствор ECM и органоиды, перенести повторно суспендированные органоиды в коническую трубку объемом 15 мл и поместить их на лед. Соберите несколько лунок одних и тех же органоидов в одну коническую трубку. Если несколько разных органоидов (разные доноры, разные участки, разное предварительное лечение и т.д.) расщепляются одновременно, соберите их в разные конические трубки. Во время сбора поддерживайте конические трубки на льду. Вращайте образцы при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно удалите PBS пипеткой, чтобы сохранить органоидную гранулу на дне. Избегайте использования вакуумной системы отходов со встроенной пипеткой, так как гранулы органоидов очень рыхлые и могут быть легко аспирированы при слишком быстром удалении PBS. Добавьте 1 мл 0,05% трипсина в коническую трубку и повторно суспендируйте органоиды, пипеткой вверх и вниз 10 раз пипеткой P1000. Инкубируют коническую трубку, содержащую органоиды при 37 °C, в течение 3 мин. Добавьте 2 мл среды DMEM/F12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина, чтобы остановить пищеварение и повторно суспендировать, чтобы разрушить органоиды путем пипетки вверх и вниз 10 раз пипеткой P1000. Вращайте образцы при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Извлеките конические трубки из центрифуги и храните их на льду. Осторожно удалите среду / трипсин с помощью одноразовой пипетки 5 мл, чтобы сохранить органоидную гранулу на дне. Оставьте около 500 мкл носителя и удалите его с помощью пипетки P1000. После того, как среда/трипсин были удалены из всех конических трубок, удалите 24-луночную пластину, обработанную неклеточной культурой, из инкубатора с температурой 37 °C и поместите ее под капот клеточной культуры. Добавьте 100% раствор ECM (хранящийся на льду) в коническую трубку с расщепленными органоидами в соотношении от 1:3 до 1:5 в зависимости от привычек роста отдельных донорских органоидов. (Например, если была пропущена одна скважина, содержащая 20-100 органоидов в 50 мкл капли раствора ECM, повторно суспендировать органоидную гранулу в 150-250 мкл ледяного раствора ECM.) Семена 50 мкл раствора ECM/органоидной смеси на лунку 24-луночной неклеточной обработанной культурой пластины, предварительно нагретой до 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор ECM будет полимеризоваться очень быстро после нагревания. Держите раствор ECM холодным в любое время (хранится на льду) во время использования. Когда органоиды будут повторно суспендированы, сразу же посейте на новую пластину. Для новичков рекомендуется хранить коробку с наконечниками пипеток при -20 °C, чтобы дать дополнительное время для посева. Инкубируйте 24-луночную пластину при 37 °C в течение 10-15 мин, чтобы дать раствору ECM полимеризоваться. После полимеризации добавляют 500 мкл питательной среды(таблица 1)26 к каждой лунке и инкубируют органоиды при 37 °C. Ежедневно проверяйте органоиды с помощью микроскопии. Меняйте носитель каждые 2 дня, как показано в шаге 1.4. 2. Подготовка органоидов в двух измерениях (2D) к апикальной инфекции ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол будет описывать, как засеять кишечные органоиды в качестве монослоя клеток в пластине клеточной культуры для заражения клеток эпителия кишечника с их апикальной стороны. Используйте 48-луночную пластину для экспериментов по секвенированию и слайд камеры со стеклянным дном из 8 скважин для борьбы с инфекцией с использованием иммунофлуоресцентных подходов. Выращивайте и поддерживайте органоиды, как описано в разделе 1. Перед посевом органоидов в 2D покройте 48-луночные пластины и 8-луночную стеклянную нижнюю камеру 200 мкл 2,5% человеческого коллагена в воде на скважину в течение 1 ч при 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Кишечные органоиды лучше всего разменять в 48-луночных пластинах и в 8-луночной камере со стеклянным дном. Опыт показал, что они плохо заражаются в 96-луночных пластинах. Трансвелл-вставки также могут быть использованы для устранения как апикальной, так и базолатеральной инфекции в 2D. Если используются трансвеллы, контролируйте трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) до заражения, чтобы подтвердить сливающийся монослой. В норме кишечные органоиды имеют плотный барьер с TEER 450-600Ом/см2. Посейте 100-150 органоидов в каждую скважину из 48-луночной пластины или в одну лунку из 8-луночной камеры со стеклянным дном. Чтобы оценить количество органоидов, подсчитайте количество органоидов, присутствующих в 50 мкл раствора ECM капли 24-луночной пластины, приготовленной в разделе 1. В среднем необходимо 1-2 скважины, которые дадут примерно 15 000-30 000 клеток. Чтобы нарушить работу раствора ECM и трипсинизировать органоиды, выполните шаги 1.8-1.17. Удалите человеческий коллаген с 48-луночных пластин и слайда камеры со стеклянным дном из 8 лунок. Повторно суспендировать органоидную гранулу в конической трубке в 250 мкл питательной среды/лунку и добавить смесь в колодцы, покрытые коллагеном. Поместите пластину в инкубатор при температуре 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении экспериментов сравниваются множественные состояния (имитация и инфицированное +/- лечение, представляющее интерес). Чтобы свести к минимуму изменчивость между каждой лункой 2D-засеянных органоидов, соберите общее количество необходимых органоидов в одной конической трубке. При сборе органоидов из 12 лунок 24-луночной пластины можно использовать 1 мл трипсина и 2 мл нейтрализующей среды. При использовании 12-24 скважин увеличьте это до 2 мл трипсина и 4 мл нейтрализующих сред. Через 48 ч снимите пластину с инкубатора и поместите ее в вытяжку для культивирования клеток. Удалить питательную среду и заменить ее 250 мкл на лунку дифференцировочной среды(табл. 1). Повторите это изменение носителя через 48 часов. Через 48 ч подтвердить дифференцировку (через четыре дня после перехода на дифференцировочные среды) путем извлечения РНК, получения кДНК с 250 нг РНК и выполнения qPCR на основе SYBR на зеленой основе с использованием праймеров для стволовых клеток (OLFM4 и / или SMOC2), бокаловидных клеток (MUC2), энтероэндокринных клеток (CHGA) и энтероцитов (SI и / или CYP3A4)(рисунок 3).ПРИМЕЧАНИЕ: При переходе от питательной среды к дифференцировочным средам органоиды уменьшат экспрессию маркеров стволовых клеток (OLFM4 и/или SMOC2) и увеличат экспрессию бокаловидных клеток (MUC2), энтероэндокринных клеток (CHGA) и энтероцитов (SI и/или CYP3A4) маркеров qPCR. Подготовьте дополнительный колодец и поддерживайте с помощью питательных сред, чтобы сравнить уровень экспрессии каждого маркера, специфичного для типа клетки, в среде роста и дифференцировки. При подтверждении дифференцировки органоиды готовы к апикальному инфицированию. Переместите органоиды на уровень биобезопасности, необходимый для патогена выбора.ВНИМАНИЕ: Обратитесь к местным правилам института и стандартным рабочим процедурам при обращении с патогенами в изоляции BSL-2 или BSL-3. Для заражения кишечных органоидов, выращенных в 2D, с их апикальной стороны удаляют среду пипеткой Р1000 и добавляют патоген, разбавленный при кратности инфекции, необходимой для эксперимента, в дифференцирующих средах (минимальный объем смеси патоген/среда составляет 50 мкл на лунку, а максимальный объем – 250 мкл на лунку). Дайте инфекции продолжаться в течение 2 ч при 37 °C либо с коромыслом, расположенным в инкубаторе клеточной культуры, либо вручную раскачивая пластину каждые 15-20 минут. Оптимизируйте это время в зависимости от выбранного патогена. Через 2 ч удалите носитель пипеткой P1000 и замените его 250 мкл на лунку свежей дифференцирующей среды. Инкубировать клетки при 37 °C до точки времени секвенирования одиночных клеток. Чтобы подготовить клетки к секвенированию одиночных клеток, перейдите к разделу 4. 3. Подготовка органоидов в трехмерном виде (3D) для апикальной и базолатеральной инфекции Выращивайте органоиды, как описано в разделе 1, в 24 лунке, обработанной неклеточной культурой пластине. Через два дня после прохождения извлеките пластину из инкубатора и поместите в вытяжку для культивирования клеток. Удалите питательную среду пипеткой P1000, замените ее 500 мкл/лунку дифференциационной среды, предварительно нагретой до комнатной температуры, и поместите пластину в инкубатор при температуре 37 °C. Через 48 ч заменить свежими дифференцирующими средами (500 мкл/лунка).ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды поддерживаются в дифференцирующих средах в общей сложности за 4 дня до заражения. Подтвердите дифференциацию, как описано в шаге 2.9. После подтверждения того, что дифференциация произошла, органоиды готовы к заражению. Оттаивание ECM на льду. Нагрейте дифференциаторную среду до комнатной температуры и прогрейте 24-луночную пластину при 37 °C. Для выполнения инфекций удаляют органоиды из раствора ECM.ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите как можно больше раствора ECM, так как вирусы предпочитают придерживаться раствора ECM, а не клеток. Если вокруг органоидов остается слишком много раствора ECM, то инфекционность будет серьезно затронута. Нарушайте ECM, добавляя 500 мкл холодного 1x PBS и инкубируя в течение 3 минут. Используйте P1000 для пипетки вверх и вниз в 10 раз. Органоиды соединить в пробирке и центрифуге по 500 х г в течение 5 мин. Удалите PBS с помощью P1000.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму изменчивость между каждым инфекционным состоянием, объедините органоиды, поступающие из нескольких скважин 24-луночной пластины, в одну коническую трубу. Например, если требуется восемь условий для заражения, восемь скважин из 24-луночной пластины (содержащей ~ 100 органоидов каждая) будут объединены и впоследствии разделены на восемь скважин новой 24-луночной пластины после разрушения иглой (см. шаг 3.12). Повторное суспендирование органоидов в 1 мл дифференцирующих сред. Для апикальной и базолатеральной инфекции следуйте шагу 3.10.1, а для базолатеральной инфекции следуйте только шагу 3.10.2. Прикрепите иглу весом 27 г к шприцу объемом 1 мл и повторно суспендируйте гранулу шесть раз, чтобы обеспечить нарушение работ органоидов и инфекцию как на апикальной, так и на базолатеральной сторонах. Перейдите к шагу 3.11.ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды должны быть классическими органоидами, похожими на кисты и осьминогом, с темным центром, когда они наблюдаются до разрушения иглы. После разрушения эти органоиды будут казаться меньше с меньшим или нулевым темным интерьером. При выполнении инфекции всегда будет минимум два условия (имитация и инфекция), минимум две скважины из 24-луночной пластины будут первоначально объединены в коническую трубку объемом 15 мл для разрушения на основе иглы (объясняя, почему для повторного суспендирования используется минимум 1 мл). При выполнении более двух условий объединяют до 10 скважин 24-луночной пластины в одну коническую трубку объемом 15 мл и повторно суспендируют в 1 мл дифференцировочной среды для разрушения иглы. После разрушения добавьте 500 мкл дифференцировочной среды на n + 1 (например, если используется 10 скважин, то доливайте 4,5 мл, чтобы получить 5,5 мл всего). Если требуется более 10 условий, используйте несколько конических трубок. Рекомендуется шприц объемом 1 мл, так как органоиды лучше разрушаются с этим объемом шприца. Альтернативой шприцу является использование хорошо сплющенного наконечника P1000. Повторное суспендирование органоидов в 500 мкл дифференцировочных сред на лунку. Будьте осторожны, чтобы не нарушить органоиды и убедиться, что апикальная сторона недоступна. Перейдите к шагу 3.11. Перенесите 500 мкл органоидных суспензий на скважину на 24-луночную пластину для культивирования клеток с помощью пипетки P1000 и переместите пластину на уровень биобезопасности, необходимый для патогена выбора.ВНИМАНИЕ: Обратитесь к местным правилам и стандартным рабочим процедурам института при обращении с патогенами в изоляции BSL-2 или BSL-3. Всегда выполняйте разрушение иглой органоидов вне BSL-3, чтобы избежать потенциальных несчастных случаев с иглой. Местные правила могут также препятствовать использованию игл в BSL-3. Добавьте патоген, разбавленный в дифференцировочных средах, чтобы достичь множественности инфекции, необходимой для эксперимента. Не превышать общий объем 500 мкл (иметь 1 мл всего в 24-луночной плите). Дайте инфекции продолжаться в течение 2 ч (это время нужно будет адаптировать к патогену по выбору) при 37 °C либо с коромыслом, расположенным в инкубаторе клеточной культуры, либо вручную раскачивая пластину каждые 15-20 минут. После 2-часовой инкубации соберите органоиды в одну трубку объемом 1,5 мл для каждого условия и вращайте при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите среду, содержащую патоген, пипеткой P1000 и храните ее на льду. Вымойте гранулы органоидов один раз с PBS. Повторно суспендируют органоиды в 50 мкл 100% раствора ECM (который ранее размораживали на льду), пластину в 24-луночную неклеточную обработанную культурой пластину предварительно нагреют до 37 °C и инкубируют 24-луночную пластину при 37 °C в течение 10-15 мин, чтобы позволить раствору ECM полимеризоваться. После полимеризации добавляют 500 мкл дифференцировочной среды при комнатной температуре в каждую лунку и инкубируют при 37 °C до сбора урожая для секвенирования одной клетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Если сбор урожая должен происходить более 48 часов после посева, меняйте носитель каждые 2 дня, удаляя старый носитель и заменяя его 500 мкл свежих дифференцирующих сред. Однако опыт показал, что, поскольку органоиды выращиваются под дифференцировочными средами, они не выживают намного дольше 48 ч. 4. Приготовление одноклеточного раствора и приготовление гелевых шариков в эмульсии (ГЭМ) в условиях уровня биобезопасности 3 (BSL-3) ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения следующих этапов необходимо, чтобы внутри установки BSL-3 присутствовали оборудование для секвенирования однойклетки (Таблица материалов)и машина ПЦР, способная обрабатывать реакции 100 мкл. Органоиды выращивают, как описано в разделе 1, и заражают, как описано в разделах 2-3, в зависимости от патогена и пути проникновения. В заранее определенное время после заражения органоиды извлекаются. Ниже описан метод, используемый для извлечения кишечных органоидов. Перед извлечением инфицированных органоидов удалите шарики одноклеточного геля(Таблица материалов)от -80 °C и прогрейте до комнатной температуры (не менее чем за 30 мин до этого). Кроме того, уравновешивайте реагент RT, восстановитель B и фермент RT C (все они хранятся при -20 °C) до комнатной температуры. Повторное суспендирование шаблона переключателя олиго, как описано в инструкции производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги должны быть выполнены в отношении местных правил биобезопасности в соответствии с установленной стандартной операционной процедурой для рассматриваемого патогена. Как правило, для работы BSL-3 необходимо обеспечить надлежащую дезинфекцию внешней стороны всех сосудов (пластин, трубок и т. Д.), Выходящих из вытяжки клеточной культуры. То же самое относится и к рукам/перчаткам человека, проводящего эксперименты. Для выполнения инфекций на органоидах, посеянных в 2D (раздел 2), перейдите к шагу 4.4. Для выполнения инфекций на 3D органоидах (раздел 3) перейдите к разделам 4.5. При инфекциях 2D-органоидов внесите пластину клеточной культуры в капот и удалите дифференцирующую среду с помощью пипетки P1000. Добавьте 250 мкл 1x PBS при комнатной температуре в каждую лунку. Удалите PBS с помощью пипетки P1000 и добавьте 250 мкл фермента диссоциации комнатной температуры (например, TrypLE Express) в каждую лунку 48-луночной пластины. Смените перчатки, очистите пластину и поместите пластину с ферментом диссоциации в инкубатор с температурой 37 °C. Наблюдают диссоциацию клеток с помощью микроскопии каждые 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно, требуется 15 минут, чтобы диссоциировать кишечные органоиды, культивируемые в 2D, в отдельные клетки. Это время необходимо будет скорректировать, так как оно будет зависеть от того, сколько органоидов было первоначально посеяно и инфицировано, а также от патогена, поскольку некоторые патогены являются более цитопатическими и заставляют органоиды диссоциировать намного быстрее, чем другие. После подтверждения очевидной одноклеточной суспензии верните пластину обратно в вытяжку клеточной культуры и остановите пищеварение путем добавления 250 мкл среды DMEM/F12, содержащей 10% FBS на лунку 48-луночной пластины. Соберите клетки в коническую трубку объемом 15 мл с помощью пипетки P1000. Смените перчатки, очистите трубку и раскрутите образцы при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно удалите среду / фермент диссоциации с помощью P1000 для поддержания клеточной гранулы на дне. Повторное суспендирование одиночных клеток в минимальном объеме PBS, содержащем 0,1% BSA. Для кишечных органоидов повторно суспендировать в 250 мкл на каждую лунку 48-луночной пластины. Передайте суспензии клеток в трубку FACS с фильтром, чтобы удалить все большие скопления и поместить трубку FACS, содержащую ячейки, на лед. Перейдите к шагу 4.6, чтобы продолжить подсчет клеток и подготовку мастер-микса. При инфекциях 3D органоидов извлеките пластину из инкубатора и поместите ее в вытяжку клеточной культуры. Удалите дифференцирующую среду из каждой лунки 24-луночной пластины пипеткой P1000. Добавьте 500 мкл ледяного 1x PBS в каждую лунку и высиживайте в течение 3 минут на льду. Чтобы обеспечить полное нарушение работы ECM-решения, используйте пипетку P1000 (450 мкл). Пипетка вверх и вниз 10 раз для повторного суспендирования PBS, раствора ECM и органоидов; переложить ресуспендированные органоиды в коническую трубку объемом 15 мл и поместить на лед. Соберите каждое инфекционное состояние в свою собственную коническую трубку объемом 15 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование конической трубки объемом 15 мл дает лучшую, более отчетливую ячейку гранулы, чем коническая трубка объемом 50 мл или трубка объемом 1,5 мл. Смените перчатки и снимите трубку с вытяжки клеточной культуры. Очистите внешнюю часть трубки. Вращайте образцы при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Переместите трубку обратно в вытяжку клеточной культуры и удалите PBS с помощью пипетки P1000, чтобы избежать повторного использования гранул органоидов со дна трубки. Повторно суспендировать гранулу в 1 мл фермента диссоциации (например, TrypLE Express). Смените перчатки, очистите трубку и инкубируйте образцы при температуре 37 °C. Каждые 10 мин в течение 30 мин перемещайте трубку обратно в вытяжку клеточной культуры и повторно суспендируйте органоиды, пипеткой вверх и вниз пипеткой P1000 10 раз.ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно кишечным органоидам требуется около 30 минут, чтобы сформировать одноклеточную суспензию при заражении в 3D. Чтобы определить, когда органоиды диссоциируют на отдельные клетки, возьмите 10 мкл органоидной суспензии с помощью пипетки p10. Поместите суспензию в одноразовый пластиковый затвор счетчика ячеек. Запечатайте входной порт образца прозрачной лентой. Смените перчатки и очистите внешнюю часть счетчика клеток. Используйте микроскоп brightfield, чтобы определить, сделана ли одноклеточная суспензия. После подтверждения одноклеточной суспензии остановите пищеварение, добавив 1 мл среды DMEM/F12, содержащей 10% FBS, и пипетку вверх и вниз 10 раз пипеткой P1000. Смените перчатки, очистите трубку и раскрутите образцы при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно удалите фермент медиа/диссоциации пипеткой P1000, чтобы избежать повторного использования клеточной гранулы со дна трубки. Повторное суспендирование одиночных клеток в минимальном объеме PBS, содержащем 0,1% BSA. Для кишечных органоидов повторно суспендируют в 250 мкл. Передайте суспензии клеток в трубку FACS с фильтром, чтобы удалить любые большие скопления и поместить трубку FACS, содержащую ячейки, на лед. Перейдите к шагу 4.6, чтобы продолжить подсчет клеток и подготовку мастер-микса. Определите количество ячеек на мкл, добавив 10 мкл клеточной суспензии в одноразовую пластиковую камеру подсчета клеток. Запечатайте входной порт образца прозрачной лентой перед извлечением образца из вытяжки клеточной культуры, так как на этом этапе клеточная суспензия все еще заразна. Смените перчатки, очистите камеру подсчета клеток и подсчитайте номер ячейки с помощью микроскопа Brightfield. Внутри капюшона клеточной культуры подготовьте мастер-смесь реагента RT, template Switch Oligo, восстановителя B и фермента RT C в пробирке объемом 1,5 мл в соответствии с инструкциями производителя в зависимости от количества образцов в эксперименте. Для каждого образца аликвот 33,4 мкл мастер-микса в ПЦР-трубку и хранят на льду. Добавьте клетки и воду в мастер-микс в соответствии с номером целевой ячейки, как описано в инструкции производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: 50%-60% клеток обычно восстанавливаются (т.е. при загрузке 10 000 клеток на чип для анализа используется 5000-6000 клеток). Поэтому всегда загружайте 10 000 ячеек. Если плотность клеток не позволяет этого, центрифугируют клетки и повторно суспендируют в меньшем объеме. Позаботьтесь о том, чтобы не перегружать чип, так как это приведет к засорению чипа. Кроме того, если клетки не диссоциированы должным образом, будет повышенный риск получения нескольких клеток на бусину, которые необходимо будет удалить при последующей обработке биоинформатики. Смените перчатки, переместите одноэлементный контроллер в вытяжку для культивирования клеток и подготовьте чип, поскольку чип покрыт только прокладкой, которая не запечатана.ПРИМЕЧАНИЕ: Машина должна находиться внутри капота, чтобы предотвратить воздействие инфицированных клеточных суспензий и потенциальных аэрозолей. Добавьте одноэлементный чип в держатель чипа и заполните неиспользуемые полосы 50% глицерина. Добавьте основную смесь, бусины и масло для перегородок в полосы, используемые для образцов, в соответствии с инструкциями производителя. Накройте чип прокладкой, загрузите чип в контроллер и запустите программу.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется загружать только шесть из восьми полос. Проблемы с неправильными эмульсиями часто возникают в первой и восьмой полосах. В компании говорят, что все полосы движения независимы, и этого происходить не должно; однако, если возможно, избегайте этих двух полос и запускайте две фишки, если требуется восемь образцов. По завершении программы снимите стружку и прокладку. Используйте многоканальную пипетку и перенесите 100 мкл эмульсий в чистую ПЦР-трубку. Убедитесь, что каждая скважина имеет однородный белый цвет, указывающий на то, что произошла полная эмульсия. Смените перчатки, очистите трубки и перенесите трубку ПЦР в аппарат ПЦР, который может поддерживать реакции 100 мкл. Запуск программы: 53 °C в течение 45 мин; 85 °C в течение 5 мин. По завершении храните образцы при температуре 4 °C. В этот момент обрабатывайте реакцию в соответствии с инструкциями производителя или храните при 4 °C в течение 3 дней или -20 °C в течение 1 недели. Через 5 мин при 85 °C большинство оболочек вирусов инактивируются, удаляют кДНК из BSL-3 в соответствии с обычной рабочей процедурой и выполняют библиотечные препараты в лаборатории BSL-1.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент должен быть выполнен в виде трех биологических реплик (например, в три разных дня), потому что степень дифференциации каждого типа клеток может незначительно варьироваться между каждым экспериментом. Результирующие библиотеки виртуализации могут быть по-разному проиндексированы и секвенированы вместе за один запуск виртуализации.