생체 안전 수준 3 (BSL-3) 조건 하에서 병원체 감염 및 단일 세포 염기서열분석에 대한 위장 오르가노이드 적응

인간 조직은 다음 프로토콜을 위해 대학 병원 하이델베르크에서 결장 절제술 또는 일루 생검으로부터 수신되었습니다. 이 연구는 헬싱키 선언에 따라 모든 과목의 서면 동의와 대학 병원 하이델베르크의 권고에 따라 수행되었다. 모든 샘플을 익명화 방식으로 수신 및 유지관리하였다. 프로토콜S-443/2017에 따라 대학 병원 하이델베르크의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 장 및 결장 오르가노이드의 유지 보수 및 패시징 주의: 인간 장 가구는 인간 조직또는 유도된 다능성/배아 줄기 세포로부터 유래되며, 따라서 윤리적 승인이 요구된다. 국가별 규정을 준수해야 합니다. 인간 물질은 일반적으로 테스트되지 않으므로 종종 BSL-2 물질로 간주됩니다. 실험이 이루어지는 국가에서 적절한 봉쇄 조건을 확인해야 합니다. 이전에 설명된 방법2를사용하여 격리된 조직 및/또는 생검으로부터 장 및 결장 오르간노이드를 준비한다. 또한, 환자 유래 물질 또는 iPSC로부터 오가노이드를 준비하는 방법에 대한 보다 기술적 인 세부 사항은 Lees 외 및 Mahe 외.24,25에서찾을 수 있습니다. 오르가노이드 배양이 확립되면, 오르가노이드가 장내 병원균으로 감염을 수행하도록 준비하기 위해 아래 설명된 분할 루틴을 따르십시오. 24웰 비조직 배양소에서 100% ECM 용액의 50 μL에서 20-100개의 오르가노이드를 종자 24-잘 비조직 배양처리 플레이트에 종자 20-100. 잘 성장 매체(표 1)의500 μL을 추가합니다. 기존 미디어의 250 μL을 제거하고 각각 의 새로운 성장 매체의 250 μL을 각 우물에 추가하여 2일마다 미디어를 변경합니다. 미디어를 변경하기 전에 미디어를 실온으로 데우습니다.주의: 콜드 미디어는 유기체를 포함하는 ECM 솔루션을 액화합니다. 죽은 세포의 축적으로 인해 내부가 어두워지기 시작할 때 일주일에 한 번 오르가노이드를 통과합니다. 이 예제는 그림 2에서찾을 수 있습니다. 분할 당일, ECM 용액을 -20°C에서 제거하고 얼음 위에서 해동하십시오. 37°C에서 분할한 후 오르가노이드를 시드하는 데 사용될 새로운 빈 세포 배양판을 놓습니다(이것은 적어도 1h가 필요하며 밤새 따뜻해질 수 있음). 문화 매체를 실온으로 데워보실 수 있습니다. P1000 파이펫으로 성장 매체를 제거하고 감기 1x 인산완충식식염(PBS)의 500 μL을 각 웰에 3분 동안 추가하여 ECM 용액을 부분적으로 액화하고 플레이트에서 분리한다. ECM 솔루션의 완전한 중단을 보장하려면 P1000 파이펫(450 μL에 설정)을 사용합니다. 파이펫은 PBS, ECM 용액 및 오르가노이드를 10번 위아래로 재보일시 중단하고, 재중단된 오르가노이드를 15mL 원문 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 동일한 원식 튜브에 동일한 오르가노이드의 여러 우물을 수집합니다. 여러 가지 다른 오르가노이드 (다른 기증자, 다른 섹션, 다른 사전 처리 등)가 동시에 분할되는 경우, 다른 원색 튜브에서 수집합니다. 수집하는 동안 얼음에 원추형 튜브를 유지합니다. 샘플을 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 회전시. 바닥에 오르가노이드 펠릿을 유지하기 위해 파이펫으로 PBS를 조심스럽게 제거합니다. 오가노이드의 펠릿이 매우 느슨하고 PBS를 너무 빨리 제거할 때 쉽게 흡인 될 수 있기 때문에 장착 된 파이펫이있는 진공 폐기물 시스템을 사용하지 마십시오. 원추형 튜브에 0.05% 트립신 1mL을 추가하고 P1000 파이펫으로 10번 위아래로 피펫을 사용하여 오르가노이드를 재일시 중단합니다. 37°C에서 오르가노이드를 함유한 원문관을 3분 동안 배양한다. 10% 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 DMEM/F12 미디어 2mL과 1% 페니실린/연쇄절제술을 첨가하여 소화를 멈추고 P1000 파이펫으로 10번 위아래로 파이프를 사용하여 오르가노이드를 방해합니다. 샘플을 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 회전시. 원심분리기에서 원물 튜브를 제거하고 얼음에 보관하십시오. 5mL 일회용 파이펫으로 미디어/트립신을 조심스럽게 제거하여 바닥에 오르가노이드 펠릿을 유지합니다. 약 500 μL의 미디어를 그대로 두고 P1000 파이펫으로 제거하십시오. 모든 원추형 튜브에서 배지/트립신이 제거되면, 37°C 인큐베이터에서 24웰 비세포 배양 처리 플레이트를 제거하고 세포 배양 후드 아래에 놓는다. 개별 기증자 오르가노이드의 성장 습관에 따라 1:3 ~ 1:5 비율로 분할 오르가노이드를 가진 원식 튜브에 100% ECM 용액(얼음에 보관)을 추가합니다. 예를 들어, ECM 용액의 50 μL 방울에 20-100 개의 오르가노이드를 잘 함유 한 개가 통과 된 경우, 오르가노이드 펠릿을 얼음 차가운 ECM 용액의 150-250 μL로 재연하십시오.) 종자 50 μL 의 ECM 용액/오가노이드 혼합은 24웰비세포 배양처리 플레이트의 웰당 37°C로 예열하였다.참고: ECM 솔루션이 따뜻해지면 매우 빠르게 중합됩니다. 사용 중에 ECM 용액을 항상 차갑게 유지하십시오(얼음에 보관됨). 오르가노이드가 다시 중단되었을 때, 새 접시에 즉시 씨앗을 드세요. 초보자의 경우 파종에 대한 추가 시간을 허용하려면 -20 °C의 파이펫 팁 상자를 저장하는 것이 좋습니다. ECM 용액이 중합할 수 있도록 10-15분 동안 37°C에서 24웰 플레이트를 배양한다. 중합화 에 이어, 각 웰에 500 μL(표1)26을 추가하고 37°C에서 오르가노이드를 배양한다. 현미경 검사법으로 매일 오가노이드를 확인하십시오. 1.4 단계와 같이 2 일마다 미디어를 변경합니다. 2. 정압 감염에 대한 2 차원 (2D)의 오르가노이드 준비 참고: 다음 프로토콜은 장 상피 세포를 자신의 정문 측에서 감염시키기 위해 세포 배양 판에 있는 세포의 단층으로 장 기관가노이드를 종자하는 방법을 설명합니다. 48웰 플레이트를 사용하여 시퀀싱 실험과 8웰 유리 바닥 챔버 슬라이드를 사용하여 면역 형광 접근법을 사용하여 감염을 제어하십시오. 1항에 설명된 대로 오르가노이드를 재배하고 유지합니다. 2D의 파종 오르가노이드에 앞서 48웰 플레이트와 8웰 유리 바닥 챔버 슬라이드를 37°C에서 1시간 동안 우물당 2.5%의 인간 콜라겐200 μL로 코팅합니다.참고: 장 내 오르가노이드는 48웰 플레이트와 8웰 유리 바닥 챔버 슬라이드에서 가장 잘 시드됩니다. 경험은 그들이 96 잘 접시에 잘 감염되지 않는 것으로 나타났습니다. 트랜스웰 인서트도 2D에서 정압 및 바소포탈 감염을 모두 허용하는 데 사용할 수 있습니다. 트랜스웰이 사용되는 경우 감염 전에 트랜스 상피 전기 저항(TEER)을 모니터링하여 컨플루천 모노레이어를 확인합니다. 일반적으로 장 가구는 450-600 Ohm/cm 2의 TEER로 단단한 장벽을 가지고있습니다. 48웰 플레이트의 각 웰 또는 8웰 유리 바닥 챔버 슬라이드의 한 웰에 100-150 개의 오르가노이드를 시드하십시오. 오르가노이드의 수를 추정하기 위해, 섹션 1에 준비된 24웰 플레이트의 ECM 용액 낙하 50 μL에 존재하는 오르가노이드의 수를 계산한다. 평균적으로 1-2 개의 우물이 필요하며 약 15,000-30,000 개의 세포를 제공합니다. ECM 용액을 방해하고 오르가노이드를 트립시화하려면 1.8-1.17 단계를 따르십시오. 48웰 플레이트와 8웰 유리 바닥 챔버 슬라이드에서 인간의 콜라겐을 제거합니다. 원내 튜브내 의 오르간노이드 펠릿을 250μL의 성장 미디어/웰에 재중단하고 콜라겐 코팅 된 우물에 혼합물을 추가합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 놓습니다.참고: 실험을 수행할 때 여러 조건이 비교됩니다(모의 대 감염된 +/- 관심 의 치료). 2D 시드 오르가노이드의 각 웰 사이의 가변성을 최소화하려면 동일한 원적 튜브에 필요한 오르가노이드의 총 수를 수집합니다. 24웰 플레이트의 최대 12개의 우물에서 오가노이드를 수집하면 트립신 1mL및 중화 미디어를 사용할 수 있습니다. 12-24 개의 우물을 사용하는 경우 트립신 2 mL 및 중화 매체의 4 mL로 증가하십시오. 48h 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 세포 배양 후드에 놓습니다. 성장 매체를 제거하고 차별화매체(표 1)의웰당 250 μL로 교체한다. 48시간 후에 이 미디어 변경을 반복합니다. 48h 후, RNA를 추출하여 분화(4일 후 전환 후 분화 매체로 전환) RNA를 추출하고, RNA250ng로 cDNA를 만들고, 줄기세포(OLFM4 및/또는 SMOC2), 잔세포(MUC2), 장내세포(CHGA), 장외세포(CHGA), 장외세포(CHGA),장내세포(CHGA), 장신세포(CHGA), 장내세포(CHGA) 및 CY4(3)를 위한 프라이머를 사용하여 SYBR 그린 기반 qPCR을 수행하였다.참고: 성장 매체에서 분화 매체로 전환하면 오르가노이드는 줄기 세포 마커(OLFM4 및/또는 SMOC2)의 발현을 감소시키고 잔 세포(MUC2), 장내분비 세포(CHGA), 및 장신구(SI 및/또는 CYP3A4) 마커를 qPCR에 의한 마커를 증가시합니다. 성장 매체와 차별화된 각 세포 형 별 마커의 발현 수준을 비교하기 위해 성장 매체와 함께 추가적인 양호한 준비를 하고 유지한다. 차별화가 확인되면, 오르가노이드는 정색 감염에 대한 준비가되어 있습니다. 선택의 병원체에 필요한 생물 안전 수준 봉쇄로 오르가노이드를 이동합니다.주의: BSL-2 또는 BSL-3 봉쇄하에서 병원균을 취급할 때 연구소의 현지 규정 및 표준 운영 절차를 참조하십시오. 그들의 apical 측에서 2D로 자란 장 기관가노이드를 감염시키기 위하여는, P1000 파이펫을 가진 매체를 제거하고 분화 매체에 있는 실험에 요구되는 감염의 복합성에서 희석된 병원체를 추가합니다 (병원체/미디어 혼합의 최소 부피는 우물 당 50 μL이고 최대 부피는 잘 당 250 μL입니다). 감염이 세포 배양 인큐베이터에 있는 로커 테이블과 함께 37°C에서 2시간 동안 진행하거나 15-20분마다 수동으로 플레이트를 흔들어 서도록 한다. 선택의 병원체에 기초하여이 시간을 최적화합니다. 2시간 후 P1000 파이펫으로 미디어를 제거하고 신선한 분화 매체당 250 μL로 교체하십시오. 단일 세포 염기서열 분석의 시점까지 37°C에서 세포를 배양한다. 단세포 시퀀싱을 위해 세포를 준비하려면 섹션 4로 진행하십시오. 3. 기형 및 바소포측 감염에 대한 3차원(3D)으로 오가노이드 를 준비 24개의 잘, 비세포 배양 처리 플레이트에서 제1항에 설명된 바와 같이 오르가노이드를 성장시한다. 2 일 후 통과, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 세포 배양 후드에 배치. P1000 파이펫으로 성장 매체를 제거하고, 실온으로 미리 데온된 분화 매체의 500 μL/웰으로 대체하고 플레이트를 37°C 인큐베이터에 놓습니다. 48h 후, 신선한 분화 매체 (500 μL / 웰)로 대체합니다.참고: 오르가노이드는 감염 전 총 4일 동안 분화 매체에서 유지됩니다. 2.9 단계에서 설명된 바와 같이 분화를 확인합니다. 차별화가 발생했다는 것을 확인하면 오르가노이드는 감염할 준비가 되어 있습니다. 얼음에 ECM을 해동. 분화 매체를 실온으로 데우고 24웰 플레이트를 37°C에서 따뜻하게 합니다. 감염을 수행하려면 ECM 용액에서 오르가노이드를 제거합니다.참고: 바이러스가 세포가 아닌 ECM 솔루션에 충실하는 것을 선호하기 때문에 가능한 한 많은 ECM 솔루션을 제거합니다. 오르가노이드 주위에 남아 있는 ECM 해결책이 너무 많은 경우에, 그 때 감염성은 가혹하게 영향을 받을 것입니다. 감기 1x PBS 500 μL을 추가하고 3분 동안 배양하여 ECM을 방해합니다. P1000을 사용하여 10배 위아래로 파이펫을 사용하십시오. 튜브에 오르가노이드와 원심분리기를 500 x g로 5분 간 결합합니다. P1000으로 PBS를 제거합니다.참고: 각 감염 조건 간의 가변성을 최소화하려면 24웰 플레이트의 여러 우물에서 나오는 오르가노이드를 동일한 원문 튜브로 결합합니다. 예를 들어, 감염을 위한 8개의 조건이 필요한 경우에, 24웰 플레이트의 8개의 우물(각각 ~100개의 오르가노이드 포함)를 결합하고 그 후에 바늘 중단 다음 새로운 24웰 플레이트의 8개의 우물로 나뉩니다(단계 3.12 참조). 분화 매체의 1 mL에서 오르가노이드를 다시 중단합니다. 정압 및 바소포탈 감염의 경우 3.10.1단계를 따르고 바소포측 감염은 3.10.2단계를 따르십시오. 27 G 바늘을 1mL 주사기에 부착하고 펠릿을 6번 다시 분리하여 오르가노이드의 붕괴를 허용하고 감염이 정문 및 바식사이드 모두에서 발생하도록 합니다. 3.11 단계로 진행합니다.참고: 오르가노이드는 바늘 붕괴 전에 관찰 될 때 어두운 중심을 가진 고전적인 낭종 모양과 문어 로이건이어야합니다. 중단 후, 이러한 오르가노이드는 어두운 내부가 적어 작게 나타납니다. 감염을 수행 할 때, 항상 두 가지 조건 (모의 및 감염)의 최소가있을 것이다, 24 웰 플레이트의 최소 2 개의 우물은 처음에 바늘 기반 의 중단을위한 15 mL 원추형 튜브로 결합될 것입니다 (최소 1 mL가 재서스펜션에 사용되는 이유를 설명). 2개 이상의 조건을 수행할 때, 단일 15mL 원추형 튜브에 24웰 플레이트의 최대 10개의 우물을 결합하고 바늘 붕괴를 위한 분화 매체의 1mL에서 재주중단한다. 중단 후, n + 1당 분화 매체의 500 μL을 추가합니다(예: 10개의 우물을 사용하는 경우 4.5mL로 위로 올려 합계 5.5mL). 10개 이상의 조건이 필요한 경우 여러 원문 튜브를 사용합니다. 1 mL 주사기는 오르가노이드가 주사기의 이 부피로 더 잘 중단되기 때문에 권장됩니다. 주사기의 대안은 잘 평평해진 P1000 팁을 사용하는 것입니다. 잘 당 분화 매체의 500 μL에서 오르가노이드를 다시 중단합니다. 오르가노이드를 방해하지 않도록주의하고 apical 측에 접근 할 수 없습니다 있는지 확인하십시오. 3.11 단계로 진행합니다. P1000 파이펫을 사용하여 24웰 세포 배양 판에 잘 당 500 μL의 요도형 현탁액을 전달하고 선택된 병원체에 필요한 생체 안전 수준 봉쇄로 플레이트를 이동한다.주의: BSL-2 또는 BSL-3 봉쇄하에서 병원균을 취급할 때 현지 규정 및 연구소의 표준 운영 절차를 참조하십시오. 항상 바늘과 잠재적인 사고를 피하기 위해 BSL-3 외부 오르가노이드의 바늘 중단을 수행합니다. 현지 규정은 또한 BSL-3에서 바늘의 사용을 방지할 수 있습니다. 분화 매체에 희석된 병원균을 추가하여 실험에 필요한 감염의 복합성에 도달한다. 총 부피 500 μL을 초과하지 마십시오 (24 웰 플레이트에 총 1 mL을 가지려면). 감염이 세포 배양 인큐베이터에 위치하거나 15-20 분마다 수동으로 플레이트를 흔들어 37 °C에서 (이 시간은 선택의 병원체에 적응해야합니다)에 대한 진행을 허용합니다. 2h 인큐베이션에 이어, 조건당 1.5mL 튜브로 오르가노이드를 수집하고 4°C에서 5분 동안 500 x g에서 회전한다. P1000 파이펫으로 병원균이 함유된 미디어를 제거하고 얼음 에 저장합니다. PBS로 오가노이드 펠릿을 한 번 씻으십시오. 100% ECM 용액(이전에 얼음에 해동되었던) 50 μL에서 오르가노이드를 재연하여 플레이트를 37°C로 예온한 24웰 비세포 배양판으로 플레이트를 재침하고 ECM 용액이 중합할 수 있도록 37°C에서 24웰 플레이트를 배양한다. 중합에 이어, 실온에서 분화 매체의 500 μL을 각 우물에 넣고 단일 세포 시퀀싱을 위해 수확할 때까지 37°C에서 배양한다.참고: 수확후 48시간 이상 발생해야 하는 경우, 기존 미디어를 제거하고 500μL의 신선한 분화 매체로 대체하여 2일마다 미디어를 변경합니다. 그러나, 경험은 오르가노이드가 분화 매체에서 성장하기 때문에, 그들은 48 h보다 훨씬 더 오래 살아남지 않을 것이라는 점을 보여주었습니다. 4. 생물안전 수준 3(BSL-3) 조건에서 단일 세포 용액 의 제조 및 젤 비드 인 에멀젼(GEM) 제제 참고: 다음 단계의 완료는 BSL-3 시설 내부에 100 μL 반응을 처리할 수 있는 단일 셀 시퀀싱장비(재료 표)와PCR 기계가 있어야 합니다. 오르가노이드는 1항에 설명된 대로 재배되고 병원체 및 진입 경로에 따라 섹션 2-3에 기재된 대로 감염된다. 감염 후 미리 결정된 시간에 오르가노이드를 수확합니다. 소장 오르가노이드를 수확하는 데 사용되는 방법 아래에 설명되어 있습니다. 감염된 오르가노이드를 수확하기 전에 단일 세포 젤구슬(재료 표)을-80°C에서 제거하고 실온(최소 30분 이전)으로 따뜻하게 제거하십시오. 또한 RT 시약, 감소제 B 및 RT 효소 C(모두 -20°C에 저장됨)를 실온에 평형화합니다. 제조업체의 지침에 설명된 대로 템플릿 스위치 올리고를 다시 일시 중지합니다.참고: 고려된 병원체에 대한 확립된 표준 운영 절차에 따라 지역 생물안전 규정에 대하여 다음의 모든 단계를 수행해야 합니다. BSL-3 작업에 대한 엄지 손가락의 규칙으로, 세포 배양 후드를 빠져나가는 모든 혈관 (플레이트, 튜브 등)의 외관이 제대로 제거되도록해야합니다. 실험을 수행하는 사람의 손/장갑도 마찬가지입니다. 2D(섹션 2)에서 시드된 오르가노이드에 대한 감염을 수행하려면 4.4단계로 진행된다. 3D 오르가노이드(섹션 3)에 감염을 수행하려면 섹션 4.5로 진행됩니다. 2D 오르가노이드의 감염의 경우, 세포 배양판을 후드에 넣고 P1000 파이펫으로 분화 매체를 제거한다. 실온에 1x PBS의 250 μL을 각 우물에 추가합니다. P1000 파이펫으로 PBS를 제거하고 48웰 플레이트의 각 웰에 실온 해리 효소(예: 트립LE 익스프레스)를 250 μL을 추가합니다. 장갑을 변경하고, 접시를 청소하고, 37°C 인큐베이터에 해리 효소로 접시를 놓습니다. 5분마다 현미경으로 세포 해리를 관찰하십시오.참고: 2D로 배양된 장 오르가노이드를 단일 세포로 해리하는 데는 약 15분이 걸립니다. 이 시간은 얼마나 많은 오르가노이드가 처음에 씨앗과 감염되었는지뿐만 아니라 병원균에 따라 달라지므로 일부 병원균이 더 세포병증이며 오르가노이드가 다른 병원균보다 훨씬 빨리 해리되도록 할 필요가 있습니다. 명백한 단세포 현탁액의 확인에 따라, 48웰 플레이트의 웰당 10%의 FBS를 포함하는 DMEM/F12 배지의 250 μL을 추가하여 플레이트를 다시 세포 배양 후드로 가져와 소화를 중지한다. P1000 파이펫을 사용하여 세포를 15mL 원상 관으로 수집합니다. 장갑을 변경하고 튜브를 청소하고 샘플을 500 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 회전시. P1000을 사용하여 미디어/해리 효소를 조심스럽게 제거하여 하단에 세포 펠릿을 유지합니다. 0.1% BSA를 포함하는 PBS의 최소 부피에서 단일 세포를 다시 중단합니다. 장 가루노이드의 경우 48웰 플레이트의 각 웰에 대해 250 μL로 재중단하십시오. 큰 덩어리를 제거하고 얼음에 세포를 포함하는 FACS 튜브를 배치하는 필터와 FACS 튜브에 세포 서스펜션을 전달합니다. 4.6단계로 진행하여 마스터 믹스의 셀 계산 및 준비를 계속한다. 3D 오르가노이드의 감염의 경우 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 세포 배양 후드에 놓습니다. P1000 파이펫으로 24웰 플레이트의 각 웰에서 분화 매체를 제거합니다. 500 μL의 얼음 차가운 1x PBS를 각 우물에 넣고 얼음에 3분 동안 배양합니다. ECM 솔루션의 완전한 중단을 보장하려면 P1000 파이펫(450 μL으로 설정)을 사용합니다. 파이펫 을 위아래로 10 번 PBS, ECM 용액 및 오르가노이드를 재일시 중단; 재중단된 오르가노이드를 15mL 원물 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 자신의 15 mL 원문 튜브에서 각 감염 상태를 수집합니다.참고: 15mL 원상관을 사용하면 50mL 원상 관 또는 1.5mL 튜브보다 더 좋고 더 뚜렷한 세포 펠릿을 제공합니다. 장갑을 변경하고 세포 배양 후드에서 튜브를 제거합니다. 튜브의 외부를 청소합니다. 샘플을 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 회전시. 튜브를 다시 세포 배양 후드로 이동하고 P1000 파이펫으로 PBS를 제거하여 튜브 바닥에서 오르가노이드 펠릿을 다시 중단하지 않도록하십시오. 절단 효소 (예를 들어, 트립LE 익스프레스)의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 장갑을 변경하고 튜브를 청소하고 샘플을 37 °C에서 배양합니다. 30분마다 10분마다 튜브를 세포 배양 후드로 다시 이동하고 P1000 파이펫으로 위아래로 파이프를 10번 배양하여 오르가노이드를 다시 중단합니다.참고: 일반적으로 장 내장 은 3D에 감염 될 때 단일 세포 현탁액을 형성 하기 위해 약 30 분 필요. 오르가노이드가 단일 세포로 해리되는 시기를 확인하려면 p10 파이펫을 사용하여 오가노이드 서스펜션의 10 μL을 복용하십시오. 일회용 플라스틱 셀 카운터 슬라이드에 서스펜션을 놓습니다. 명확한 테이프로 샘플 입력 포트를 밀봉합니다. 장갑을 변경하고 셀 카운터의 외부를 청소합니다. 밝은 필드 현미경을 사용하여 단일 세포 현탁액이 이루어지는지 여부를 결정합니다. 단일 셀 서스펜션의 확인에 따라, P1000 파이펫으로 10% FBS 및 파이펫을 10배 위아래로 포함하는 DMEM/F12 매체 1mL을 추가하여 소화를 중지합니다. 장갑을 변경하고 튜브를 청소하고 샘플을 500 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 회전시. 조심스럽게 튜브의 바닥에서 세포 펠릿을 다시 중단하지 않도록 P1000 파이펫으로 미디어 / 해리 효소를 제거합니다. 0.1% BSA를 포함하는 PBS의 최소 부피에서 단일 세포를 다시 중단합니다. 장 내장 의 경우 250 μL에서 재중단. 큰 덩어리를 제거하고 얼음에 세포를 포함하는 FACS 튜브를 배치하는 필터와 FACS 튜브에 세포 서스펜션을 전달합니다. 4.6단계로 진행하여 마스터 믹스의 셀 계산 및 준비를 계속한다. 일회용 플라스틱 셀 카운팅 챔버에 셀 서스펜션의 10 μL을 추가하여 μL당 세포 수를 결정합니다. 이 단계에서와 같이 세포 배양 후드에서 샘플을 제거하기 전에 명확한 테이프로 샘플 입력 포트를 밀봉, 이 단계에서와 같이, 세포 현탁액은 여전히 전염성이 있다. 장갑을 변경하고, 세포 계수 챔버를 청소하고, 밝은 필드 현미경을 사용하여 세포 수를 계산합니다. 세포 배양 후드 내부에는 실험시 샘플 수에 따라 제조업체의 지침에 따라 RT 시약, 템플릿 스위치 올리고, 감소제 B 및 RT 효소 C의 마스터 믹스를 제조업체의 지침에 따라 1.5mL 튜브로 준비한다. 각 샘플에 대해 마스터 믹스 33.4 μL을 PCR 튜브에 넣고 얼음 위에 보관합니다. 제조업체의 지침에 설명된 대로 대상 세포 수에 따라 셀과 물을 마스터 믹스에 추가합니다.참고: 세포의 50%-60%는 일반적으로 복구됩니다(즉, 칩에 10,000개의 셀을 로드할 때, 5,000-6,000개의 세포가 분석에 사용됩니다). 따라서 항상 10,000개의 셀을 로드합니다. 세포 밀도가 이를 허용하지 않으면 세포를 원심분리하고 더 낮은 부피로 다시 중단합니다. 이 칩의 막힘 귀착될 것이기 때문에 칩을 과부하하지 않도록주의하십시오. 추가적으로, 세포가 제대로 해리되지 않는 경우에, 비드 당 다중 세포를 얻기의 증가한 리스크가 있을 것입니다, 다운스트림 생물정보학 처리에서 제거될 필요가 있을 것입니다. 장갑을 변경하고, 단일 셀 컨트롤러를 세포 배양 후드로 이동하고, 칩이 밀봉되지 않은 개스킷으로만 덮여 있기 때문에 칩을 준비한다.참고: 기계는 감염된 세포 현탁액 및 잠재적인 에어로졸에 노출되는 것을 방지하기 위하여 후드 안에 있어야 합니다. 단일 셀 칩을 칩 홀더에 넣고 사용하지 않은 차선을 50% 글리세롤로 채웁니다. 제조업체의 지침에 따라 샘플에 사용되는 레인에 마스터 믹스, 비즈 및 분할 오일을 추가합니다. 개스킷으로 칩을 덮고 칩을 컨트롤러에 로드하고 프로그램을 시작합니다.참고: 8개의 레인 중 6개만 로드하는 것이 좋습니다. 부적절한 에멀젼 문제가 종종 차선 1과 8차선에서 발생합니다. 회사는 모든 차선이 독립적이며, 이것은 발생하지 않아야한다고 말한다; 그러나 가능하다면 이 두 차선을 피하고 8개의 샘플이 필요한 경우 두 개의 칩을 실행합니다. 프로그램이 완료되면 칩과 개스킷을 제거합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하고 에멀젼의 100 μL을 깨끗한 PCR 튜브로 옮기십시오. 각 우물에 완전한 에멀젼이 발생했음을 나타내는 균일한 흰색 색이 있는지 확인합니다. 장갑을 교체하고 튜브를 청소하고 PCR 튜브를 PCR 기계로 전송하여 100 μL 반응을 지원할 수 있습니다. 프로그램 실행: 45분 동안 53°C; 85 °C 5 분 동안. 완료되면 샘플을 4°C로 저장합니다. 이 시점에서, 제조업체의 지시에 따라 반응을 처리하거나 3일 동안 4°C 또는 -20°C에서 1주일 동안 저장한다. 85°C에서 5분 후, 대부분의 봉투 바이러스는 정상적인 작동 절차에 따라 BSL-3로부터 cDNA를 제거하고 BSL-1 실험실에서 라이브러리 준비를 수행한다.참고: 이 실험은 각 세포 유형의 분화 정도가 각 실험 사이에 약간 다를 수 있기 때문에 3개의 생물학적 복제(예를 들어, 3일)로 수행될 필요가 있다. 결과 시퀀싱 라이브러리는 하나의 시퀀싱 실행에서 서로 다른 인덱싱 및 시퀀싱될 수 있습니다.