התאמת Organoids במערכת העיכול עבור זיהום פתוגן ורצף תא יחיד תחת בטיחות ביולוגית רמה 3 (BSL-3) תנאים

רקמה אנושית התקבלה כריתה המעי הגס או ביופסיות אילום מבית החולים האוניברסיטאי היידלברג לפרוטוקול הבא. מחקר זה נערך בהמלצת בית החולים האוניברסיטאי היידלברג בהסכמה מדעת ובכתב מכל המקצועות בהתאם להצהרת הלסינקי. כל הדגימות התקבלו והתוחזקו בצורה אנונימית. הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי היידלברג על פי פרוטוקול S-443/2017. 1. תחזוקה ועברת אורגנוידים במעיים ובמעי הגס זהירות: אורגנוידים במעיים אנושיים נגזרים מרקמה אנושית או מתאי גזע פלוריפוטנטים/עובריים, וככאלה נדרש אישור אתי. יש לציית לתקנות ספציפיות למדינה. חומר אנושי בדרך כלל לא נבדק ולכן נחשב לעתים קרובות חומר BSL-2. תנאי בלימה נאותים צריכים להיות מאושרים במדינה שבה הניסוי מתקיים. הכן אורגנוידים מעיים ומעשיית מרקמות מבודדות ו/או ביופסיות בשיטות שתוארו בעבר2. בנוסף, פרטים טכניים נוספים על איך להכין organoids מחומר שמקורו בחולה או מ- IPSCs ניתן למצוא Lees et al. ו מאהה ואח’24,25. לאחר תרבויות organoid הוקמו, בצע את שגרת הפיצול המתוארת להלן כדי להכין organoids לבצע זיהומים עם פתוגנים אנטריים. זרע 20-100 organoids ב 50 μL של 100% פתרון ECM ב 24-היטב לא רקמה תרבית מטופלים צלחות. הוסף 500 μL של מדיה צמיחה (טבלה 1) לבאר. שנה את המדיה כל יומיים על ידי הסרת 250 μL של המדיה הישנה והוספת 250 μL של מדיה צמיחה טרי לכל באר. מחממים את התקשורת לטמפרטורת החדר לפני שינוי התקשורת.זהירות: מדיה קרה יהיה נוזלי פתרון ECM המכיל organoids. מעבר האורגנוידים פעם בשבוע כאשר הפנים מתחיל להיות כהה בשל הצטברות של תאים מתים. דוגמה לכך ניתן למצוא באיור 2. ביום הפיצול, להסיר את פתרון ECM מ -20 °C (50 °F) ולהפשיר על קרח. מניחים את צלחת תרבית התא הריק החדש שישמש לזרע האורגנוידים לאחר פיצול ב 37 °C (זה דורש מינימום של 1 שעה כדי להיות חם יכול להיות מחומם לילה). לחמם את התקשורת התרבותית לטמפרטורת החדר. הסר את מדיית הצמיחה עם פיפטה P1000 ולהוסיף 500 μL של תמיסת מלח קר 1x פוספט חוצץ (PBS) לכל באר במשך 3 דקות כדי להמיס חלקית את פתרון ECM ולנתק מהצלחת. כדי להבטיח הפרעה מלאה של פתרון ECM, השתמש בצינור P1000 (מוגדר ב 450 μL). פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי resuspend PBS, פתרון ECM, אורגנוידים, להעביר את organoids resuspended לתוך צינור חרוטי 15 מ”ל ולהניח אותם על קרח. לאסוף בארות מרובות של אותם organoids לתוך אותו צינור חרוט. אם אורגנוידים שונים מרובים (תורמים שונים, חלקים שונים, טיפול מקדים שונה וכו ‘) מפוצלים בו זמנית, אוספים אותם בצינורות חרוטיים שונים. תוך כדי איסוף, לשמור על צינורות חרוט על קרח. ספין את הדגימות ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר בזהירות את PBS עם פיפטה כדי לשמור על גלולה organoid בתחתית. הימנע משימוש במערכת פסולת ואקום עם פיפטה מצוידת כמו גלולה של organoids הוא רופף מאוד יכול בקלות להיות שאיפה בעת הסרת PBS מהר מדי. הוסף 1 מ”ל של 0.05% טריפסין לצינור חרוטי ואורגנוידים resuspend על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה P1000. לדגור את הצינור החרוט המכיל organoids ב 37 °C (37 °F) במשך 3 דקות. הוסף 2 מ”ל של מדיה DMEM / F12 המכילה 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין כדי לעצור את העיכול resuspend כדי לשבש את organoids על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה P1000. ספין את הדגימות ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר צינורות חרוט מן הצנטריפוגה ולאחסן אותם על קרח. הסר בזהירות מדיה / טריפסין עם פיפטה חד פעמית 5 מ”ל כדי לשמור על גלולה organoid בתחתית. השאירו סביב 500 μL של מדיה ולהסיר את זה עם פיפטה P1000. לאחר מדיה / טריפסין הוסר מכל הצינורות חרוטיים, להסיר את 24-היטב לא תא תרבית מטופל צלחת מן החממה 37 °C ומניחים אותו מתחת למכסה המנוע תרבות התא. הוסף 100% פתרון ECM (נשמר על קרח) לצינור חרוט עם organoids פיצול ב 1:3 עד 1:5 יחס בהתאם להרגלי הצמיחה של organoids התורם בודדים. (לדוגמה, אם באר אחת המכילה 20-100 organoids ב 50 μL טיפה של פתרון ECM הועבר, resuspend הכדור organoid לתוך 150-250 μL של פתרון ECM קר כקרח.) זרע 50 μL של פתרון ECM / תערובת organoid לכל באר של 24-טוב לא תא תרבית מטופל צלחת מראש מחומם ל 37 °C (50 °F).הערה: פתרון ECM יהיה פילמור מהר מאוד ברגע שהוא התחמם. שמור על פתרון ECM קר בכל עת (מאוחסן על קרח) במהלך השימוש. כאשר organoids כבר respended, לזרוע מיד על צלחת חדשה. למתחילים, מומלץ לאחסן קופסה של טיפים פיפטה ב -20 °C (70 °F) כדי לאפשר זמן נוסף עבור זריעה. לדגור על צלחת 24-well ב 37 °C (55 °F) במשך 10-15 דקות כדי לאפשר פתרון ECM כדי פולימר. לאחר פילמור, להוסיף 500 μL של מדיה צמיחה (טבלה 1)26 לכל באר ולדגירה על organoids ב 37 °C (50 °F). בדוק את organoids מדי יום על ידי מיקרוסקופיה. שנה את המדיה כל יומיים כמו בשלב 1.4. 2. הכנת אורגנוידים בשני ממדים (2D) לזיהום אפיקלי הערה: הפרוטוקול הבא יתאר כיצד לזרוע organoids מעיים כמו monolayer של תאים בצלחת תרבית התא להדביק תאי אפיתל מעיים מהצד האפיקלי שלהם. השתמש בצלחת 48 באר לניסויי הרצף ובמגלשת התאים התחתונה של 8 בארות כדי לשלוט בזיהום באמצעות גישות אימונופלואורסצנטיות. לגדל ולתחזק organoids כמתואר בסעיף 1. לפני זריעת אורגנוידים ב 2D, לצפות את לוחות 48 באר שקופית תא 8-באר זכוכית תחתון עם 200 μL של 2.5% קולגן אנושי במים לבאר עבור 1 שעה ב 37 °C (50 °F).הערה: אורגנוידים במעיים הם הזרעים הטובים ביותר בצלחות 48-well ובמגלשה תא זכוכית 8-טוב. הניסיון הראה שהם לא מדביקים היטב בצלחות 96- well. תוספות Transwell יכול לשמש גם כדי לאפשר זיהום apical ו basolateral ב 2D. אם נעשה שימוש בטרנסוולים, יש לעקוב אחר ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתל (TEER) לפני ההדבקה כדי לאשר מונו-שכבתית. בדרך כלל, organoids מעיים יש מחסום הדוק עם TEER של 450-600 אוהם / ס”מ2. זרע 100-150 organoids בכל באר של צלחת 48-well או עבור באר אחת של שקופית תא זכוכית 8-טוב. כדי להעריך את מספר organoids, לספור את מספר organoids הנוכחי 50 μL של טיפת פתרון ECM של צלחת 24-well מוכן בסעיף 1. בממוצע, 1-2 בארות נדרשים, אשר ייתן כ 15,000-30,000 תאים. כדי לשבש את פתרון ECM ו trypsinize organoids, בצע את השלבים 1.8-1.17. הסר קולגן אנושי מהצלחות של 48 בארות ומגלשת התאים עם 8 הבאר מזכוכית. Resuspend גלולה organoid בצינור חרוט ב 250 μL של מדיה צמיחה / טוב ולהוסיף את התערובת לבארות מצופות קולגן. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.הערה: בעת ביצוע הניסויים, תנאים מרובים משווים (מדומה לעומת נגוע +/- טיפול עניין). כדי למזער את השונות בין כל באר של organoids זרעים 2D, לאסוף את המספר הכולל של organoids הדרוש באותו צינור חרוט. איסוף organoids של עד 12 בארות של צלחת 24-well יכול להשתמש 1 מ”ל של טריפסין ו 2 מ”ל של מדיה מנטרלת. בעת שימוש 12-24 בארות, להגדיל את זה ל 2 מ”ל של טריפסין ו 4 מ”ל של נטרול מדיה. לאחר 48 שעות, להסיר את הצלחת מן האינקובטור ומניחים אותו במכסה המנוע תרבות התא. הסר את מדיית הצמיחה והחלף אותה ב- 250 μL לבאר של מדיית בידול (טבלה 1). חזור על שינוי מדיה זה 48 שעות מאוחר יותר. לאחר 48 שעות, אשר הבחנה (ארבעה ימים לאחר המעבר למדיית בידול) על-ידי חילוץ RNA, יצירת cDNA עם 250 ננוגרם של RNA, וביצוע qPCR מבוסס ירוק SYBR באמצעות פריימרים לתאי גזע (OLFM4 ו/ או SMOC2), תאי גביע (MUC2), תאים אנתרואנדוקריניים (CHGA) ואנטוציטים (SI ו/ או CYP3A4) (איור 3).הערה: בעת המעבר ממדיית צמיחה למדיית בידול, organoids יקטין את הביטוי שלהם של סמני תאי גזע (OLFM4 ו/או SMOC2) ולהגדיל את הביטוי של תאי גביע (MUC2), תאים enteroendocrine (CHGA), ו enterocytes (SI ו / או CYP3A4) סמנים על ידי qPCR. הכן באר נוספת וחזק עם מדיית צמיחה כדי להשוות את רמת הביטוי של כל סמן ספציפי לסוג תא בצמיחה לעומת מדיית בידול. עם אישור ההבחנה, organoids מוכנים לזיהום אפיקלי. העבר את organoids לרמת הבטיחות הביולוגית בלימה הנדרשת עבור הפתוגן של בחירה.אזהרה: עיין בתקנות המקומיות של המכון ובהליכי ההפעלה הסטנדרטיים בעת טיפול בפתוגנים תחת בלימת BSL-2 או BSL-3. כדי להדביק את האורגנוידים במעיים הגדלים בדו-ממדי מהצד האפילי שלהם, הסר מדיה עם פיפטה P1000 והוסף פתוגן מדולל בריבוי הזיהום הנדרש לניסוי במדיה בידול (נפח מינימלי של תערובת פתוגן / מדיה הוא 50 μL לבאר והנפח המרבי הוא 250 μL לבאר). אפשר לזיהום להמשיך במשך 2 שעות ב 37 °C (57 °F) עם שולחן רוקר הממוקם בחממת תרבית התא או על ידי נדנדה ידנית את הצלחת כל 15-20 דקות. מטב את הזמן הזה בהתבסס על הפתוגן של בחירה. לאחר 2 שעות, להסיר את המדיה עם פיפטה P1000 ולהחליף אותו עם 250 μL לכל באר של מדיה בידול טרי. דגירה תאים ב 37 °C (5 °F) עד לנקודת הזמן של רצף תא יחיד. כדי להכין תאים לרצף של תא בודד, המשך לסעיף 4. 3. הכנת אורגנוידים בשלושה ממדים (3D) לזיהום אפי ובסולטרי לגדל organoids כמתואר בסעיף 1 ב 24 היטב, לא תא תרבית מטופלת צלחת. יומיים לאחר ההעברה, הסירו את הצלחת מהאינקובטור והכניסו למכסה המנוע של תרבית התא. הסר את מדיה הצמיחה עם פיפטה P1000, להחליף אותו עם 500 μL / באר של מדיה בידול מראש מחומם לטמפרטורת החדר ומניחים את הצלחת בחממה 37 °C. לאחר 48 שעות, להחליף עם מדיית בידול טרי (500 μL / טוב).הערה: Organoids נשמרים בתקשורת בידול במשך סך של 4 ימים לפני ההדבקה. אשר הבחנה כמתואר בשלב 2.9. לאחר אישור כי הבחנה התרחשה, organoids מוכנים לזיהום. להפשיר ECM על קרח. מחממים את מדיית הבידול לטמפרטורת החדר ומחממים צלחת של 24 מעלות צלזיוס. כדי לבצע זיהומים, להסיר את organoids מפתרון ECM.הערה: הסר פתרון ECM ככל האפשר כמו וירוסים מעדיפים לדבוק פתרון ECM ולא תאים. אם יש יותר מדי פתרון ECM שנותר סביב organoids, אז הדבקה תיפגע קשות. לשבש את ECM על ידי הוספת 500 μL של PBS 1x קר ודגרה במשך 3 דקות. השתמש P1000 כדי pipette למעלה ולמטה 10x. שלבו אורגנוידים בצינור וצנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות. הסר PBS עם P1000.הערה: כדי למזער את השונות בין כל מצב זיהום, לשלב את organoids מגיע מכמה בארות של צלחת 24-well לתוך אותו צינור חרוט. לדוגמה, אם נדרשים שמונה תנאים לזיהום, שמונה בארות של צלחת 24 באר (המכילה ~ 100 organoids כל אחד) ישולבו ולאחר מכן יחולקו לשמונה בארות של צלחת חדשה 24-well לאחר הפרעה מחט (ראה שלב 3.12). resuspend organoids ב 1 מ”ל של מדיה בידול. לזיהום apical ו basolateral בצע את שלב 3.10.1 ועל זיהום בזולטריאלי רק בצע את שלב 3.10.2. חבר מחט 27 G למזרק 1 מ”ל ו resuspend הכדור שש פעמים כדי לאפשר הפרעה של organoids ועל זיהום להתרחש הן בצד apical ו basolateral. המשך לשלב 3.11.הערה: האורגנוידים צריכים להיות האורגנוידים הקלאסיים למראה ציסטה ואורגנואידים עם ניצני תמנון עם מרכז כהה כאשר נצפו לפני הפרעה במחט. בעקבות ההפרעה, organoids אלה ייראו קטנים יותר עם פחות עד ללא פנים כהה. בעת ביצוע זיהום, תמיד יהיו מינימום של שני תנאים (מדומה וזיהום), מינימום של שתי בארות של צלחת 24-well יהיה משולב בתחילה לתוך צינור חרוט 15 מ”ל עבור הפרעה מבוססת מחט (להסביר מדוע מינימום של 1 מ”ל משמש resuspension). בעת ביצוע יותר משני תנאים, לשלב עד 10 בארות של צלחת 24-well בצינור חרוט יחיד 15 מ”ל resuspend ב 1 מ”ל של מדיה בידול עבור הפרעה מחט. לאחר ההפרעה, להוסיף 500 μL של מדיה בידול לכל n + 1 (לדוגמה, אם באמצעות 10 בארות, ולאחר מכן למעלה עם 4.5 מ”ל יש 5.5 מ”ל בסך הכל). אם יש צורך ביותר מ -10 תנאים, השתמש במספר צינורות חרוט. מזרק 1 מ”ל מומלץ כמו organoids הם שיבשו טוב יותר עם נפח זה של המזרק. חלופה למזרק היא להשתמש בטיפ P1000 שטוח היטב. resuspend organoids ב 500 μL של מדיה בידול לבאר. היזהר לא לשבש את organoids ולוודא כי הצד apical אינו נגיש. המשך לשלב 3.11. העבר 500 μL של השעיות organoid לבאר ללוח תרבית תאים 24-well באמצעות פיפטה P1000 ולהעביר את הצלחת לרמת הבטיחות הביולוגית בלימה הנדרשת עבור הפתוגן של בחירה.אזהרה: עיין בתקנות המקומיות ובהליכי ההפעלה הסטנדרטיים של המכון בעת טיפול בפתוגנים תחת בלימת BSL-2 או BSL-3. תמיד לבצע את הפרעת המחט של organoids מחוץ BSL-3 כדי למנוע תאונות פוטנציאליות עם המחט. תקנות מקומיות עשויות גם למנוע את השימוש במחטים ב- BSL-3. הוסף את הפתוגן מדולל למדיה בידול כדי להגיע לריבוי הזיהום הנדרש לניסוי. אין לחרוג מנפח כולל של 500 μL (יש 1 מ”ל סה”כ בלוח 24-well). אפשר לזיהום להמשיך במשך 2 שעות (הפעם יהיה צורך להתאים את הפתוגן של בחירה) ב 37 °C עם שולחן רוקר הממוקם בחממת תרבית התא או על ידי נדנדה ידנית את הצלחת כל 15-20 דקות. לאחר הדגירה 2 שעות, לאסוף את organoids לתוך צינור אחד 1.5 מ”ל לכל תנאי ולהסתובב ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר את המדיה המכילה פתוגן עם פיפטה P1000 ולאחסן אותו על קרח. לשטוף את כדורי organoids פעם אחת עם PBS. Resuspend organoids ב 50 μL של פתרון 100% ECM (אשר הופשר בעבר על קרח), צלחת לתוך צלחת 24-טוב לא תאים מטופלים מראש 37 °C (37 °C) ולדגירה צלחת 24-well ב 37 °C (10-15 דקות כדי לאפשר פתרון ECM כדי פולימר. לאחר פילמור, להוסיף 500 μL של מדיה בידול בטמפרטורת החדר לכל באר לדגור ב 37 °C (57 °F) עד קציר עבור רצף תא יחיד.הערה: אם הקציר צריך להתרחש יותר מ 48 שעות לאחר זריעה, לשנות את המדיה כל 2 ימים על ידי הסרת המדיה הישנה והחלפתה עם 500 μL של מדיה בידול טרי. עם זאת, הניסיון הראה כי מאז organoids גדלים תחת מדיה בידול, הם לא ישרדו הרבה יותר מ 48 שעות. 4. הכנת פתרון תא יחיד והכנת חרוזים-in-emulsion ג’ל (GEMs) במצבים של בטיחות ביולוגית 3 (BSL-3) הערה: השלמת השלבים הבאים דורשת כי ציוד הריצוף של תא יחיד (טבלת החומרים) ומכונת PCR המסוגלת לטפל בתגובות 100 μL נמצאים בתוך מתקן BSL-3. Organoids גדלים כמתואר בסעיף 1 נגועים כמתואר בסעיפים 2-3 בהתאם לפתוגן ולנתיב הכניסה. בזמן שנקבע מראש לאחר ההדבקה, אורגנוידים נקצרים. מתחת לשיטה המשמשת לקצור organoids מעיים מתואר. לפני קצירת אורגנוידים נגועים, להסיר את חרוזי ג’ל תא יחיד(שולחן החומרים)מ -80 °C (50 °F) וחם לטמפרטורת החדר (לפחות 30 דקות לפני). בנוסף, ישיחל ריאגנט RT, הפחתת סוכן B ואנזים RT C (כולם מאוחסנים ב -20 °C)-C) לטמפרטורת החדר. תגדיל מחדש את מתג התבנית אוליגו כמתואר בהוראות היצרן.הערה: כל השלבים הבאים צריכים להתבצע ביחס לתקנות הבטיחות הביולוגית המקומיות בעקבות נוהל ההפעלה הסטנדרטי שנקבע עבור הפתוגן הנחשב. ככלל אצבע לעבודה BSL-3, יש להבטיח כי החלק החיצוני של כל כלי הדם (צלחות, צינורות, וכו ‘) יציאה מכסה המנוע תרבית התאים מחוטאים כראוי. כנ”ל לגבי הידיים / הכפפות של האדם המבצע את הניסויים. כדי לבצע זיהומים על organoids זרעים 2D (סעיף 2) להמשיך לשלב 4.4. כדי לבצע זיהומים על organoids 3D (סעיף 3) להמשיך לסעיפים 4.5. עבור זיהומים של organoids 2D, להביא את צלחת תרבית התא לתוך מכסה המנוע ולהסיר את מדיה בידול עם פיפטה P1000. הוסיפו 250 μL של 1x PBS בטמפרטורת החדר לכל באר. הסר PBS עם פיפטה P1000 ולהוסיף 250 μL של אנזים דיסוציאציה טמפרטורת החדר (למשל, טריפל אקספרס) לכל באר של צלחת 48 טוב. החליפו כפפות, נקו את הצלחת ומניחים את הצלחת עם אנזים הדיסוציאציה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. שימו לב לניתוק התא על ידי מיקרוסקופיה כל 5 דקות.הערה: בערך, זה לוקח 15 דקות כדי לנתק אורגנוידים מעיים בתרבית 2D לתאים בודדים. הפעם יהיה צורך להתאים כפי שהוא יהיה תלוי כמה organoids היו בתחילה זרעו נגועים, כמו גם על הפתוגן כמו כמה פתוגנים הם ציטופתיים יותר ולגרום organoids להתנתק הרבה יותר מהר מאחרים. לאחר אישור של השעיית תא יחיד לכאורה, להחזיר את הצלחת לתוך מכסה המנוע תרבית התא ולעצור את העיכול על ידי הוספת 250 μL של מדיה DMEM / F12 המכיל 10% FBS לכל באר של צלחת 48-well. לאסוף את התאים לתוך צינור חרוטי 15 מ”ל באמצעות פיפטה P1000. החלף כפפות, לנקות את הצינור, ולסובב את הדגימות ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר בזהירות את האנזים מדיה/דיסוציאציה עם P1000 כדי לשמור על גלולה התא בתחתית. resuspend תאים בודדים בנפח מינימלי של PBS המכיל 0.1% BSA. עבור organoids מעיים, resuspend ב 250 μL עבור כל באר של צלחת 48-well. להעביר את מתלים התא לתוך צינור FACS עם מסנן כדי להסיר כל גושים גדולים ומניחים את צינור FACS המכיל תאים על קרח. המשך לשלב 4.6 כדי להמשיך עם ספירת תאים והכנת תערובת האב. עבור זיהומים של organoids 3D, להסיר את הצלחת מן האינקובטור ומניחים אותו במכסה המנוע תרבות התא. הסר את מדיית הבידול מכל באר של צלחת 24-well עם פיפטה P1000. הוסיפו 500 מיקרו-אל של PBS 1x קר כקרח לכל באר ודגרו במשך 3 דקות על קרח. כדי להבטיח הפרעה מלאה של פתרון ECM, השתמש בצינור P1000 (מוגדר ל- 450 μL). פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי resuspend PBS, פתרון ECM ואורגנוידים; מעבירים את האורגנוידים המחודשים לצינור חרוט של 15 מ”ל ומניחים על קרח. לאסוף כל מצב זיהום בצינור חרוט 15 מ”ל משלו.הערה: שימוש בצינור חרוטי 15 מ”ל נותן כדור תא טוב יותר, מובחן יותר מאשר צינור חרוטי 50 מ”ל או צינור 1.5 מ”ל. החליפו כפפות והסירו את הצינור ממכסה המנוע של תרבית התאים. נקה את החלק החיצוני של הצינור. ספין את הדגימות ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). הזז את הצינור בחזרה לתוך מכסה המנוע תרבית התא ולהסיר PBS עם פיפטה P1000 כדי למנוע שימוש חוזר גלולה organoids מתחתית הצינור. resuspend הכדור ב 1 מ”ל של אנזים דיסוציאציה (למשל, טריפל אקספרס). החליפו כפפות, נקו את הצינור ודגרו את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס. כל 10 דקות במשך 30 דקות, להזיז את הצינור בחזרה במכסה המנוע תרבות התא ו respend organoids על ידי צנרת למעלה ולמטה עם פיפטה P1000 10 פעמים.הערה: בדרך כלל, organoids מעיים דורשים סביב 30 דקות כדי ליצור השעיה תא יחיד כאשר נגוע בתלת-ממד. כדי לקבוע מתי organoids מנותקים לתאים בודדים, לקחת 10 μL של השעיית organoid באמצעות פיפטה p10. מניחים את המתלים במגלשה חד פעמית של תאי פלסטיק. חותם את יציאת הקלט לדוגמה עם סרט ברור. תחליף כפפות ותנקה את החלק החיצוני של הדלפק. השתמש במיקרוסקופ Brightfield כדי לקבוע אם מתבצעת השעיית תא בודד. לאחר אישור של השעיית תא יחיד, להפסיק את העיכול על ידי הוספת 1 מ”ל של מדיה DMEM / F12 המכיל 10% FBS ו pipette למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה P1000. החלף כפפות, לנקות את הצינור, ולסובב את הדגימות ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר בזהירות את האנזים מדיה / דיסוציאציה עם פיפטה P1000 כדי למנוע שימוש חוזר את גלולה התא מתחתית הצינור. תגדיל מחדש את התאים הבודדים בנפח מינימלי של PBS המכיל 0.1% BSA. עבור organoids מעיים resuspend ב 250 μL. להעביר את מתלים התא לתוך צינור FACS עם מסנן כדי להסיר כל גושים גדולים ולהניח את צינור FACS המכיל תאים על קרח. המשך לשלב 4.6 כדי להמשיך עם ספירת תאים והכנת תערובת האב. קבע את מספר התאים לכל μL על-ידי הוספת 10 μL של השעיית התא לתא ספירת תאי פלסטיק חד פעמי. חתמו את יציאת הקלט לדוגמה עם סרט ברור לפני הסרת המדגם ממכסה המנוע של תרבית התא, שכן בשלב זה, ההשעיה של התא עדיין מדבקת. החלף כפפות, נקה את תא ספירת התאים, וספור את מספר התא באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד. בתוך מכסה המנוע תרבית התא, להכין תערובת מאסטר של RT ריאגנט, תבנית מתג אוליגו, הפחתת סוכן B, ו RT אנזים C בצינור 1.5 מ”ל בהתאם להוראות היצרן בהתאם למספר הדגימות בניסוי. עבור כל מדגם, aliquot 33.4 μL של אמן לערבב לתוך צינור PCR ולאחסן על קרח. הוסף את התאים והמים לתערובת הראשית בהתאם למספר תא היעד כמתואר בהוראות היצרן.הערה: 50%-60% מהתאים נמצאים בדרך כלל (כלומר, בעת טעינת 10,000 תאים על השבב, 5,000-6,000 תאים משמשים לניתוח). לכן, תמיד לטעון 10,000 תאים. אם צפיפות התא אינה מאפשרת זאת, צנטריפוגה התאים resuspend בנפח נמוך יותר. יש להחריד לא להעמיס על השבב כמו זה יגרום סתימה של השבב. בנוסף, אם תאים אינם מנותקים כראוי, יהיה סיכון מוגבר לקבל תאים מרובים לכל חרוז, אשר יהיה צורך להסיר בעיבוד ביו-אינפורמטיקה במורד הזרם. החליפו את הכפפות, הזיזו את בקר התא הבודד למכסה המנוע של תרבית התאים והכנו את השבב מכיוון שהשבב מכוסה רק אטם שאינו אטום.הערה: המכונה צריכה להיות בתוך מכסה המנוע כדי למנוע חשיפה להשעי תאים נגועים ותרסיסים פוטנציאליים. הוסף את השבב של תא בודד למחזיק השבב ומלא את הנתיבים שאינם בשימוש בגליצריל 50%. הוסף את התערובת הראשית, החרוזים ושמן החלוקה לנתיבים המשמשים לדגימות בהתאם להוראות היצרן. לכסות את השבב עם האטם, לטעון את השבב לתוך הבקר, ולהתחיל את התוכנית.הערה: מומלץ לטעון רק שישה מתוך שמונת הנתיבים. בעיות עם אמולסיות לא נאותות מתרחשות לעתים קרובות בנתיבים 1 ו -8. החברה אומרת כי כל הנתיבים הם עצמאיים, וזה לא צריך לקרות; עם זאת, במידת האפשר, הימנע משני נתיבים אלה ולהפעיל שני שבבים אם שמונה דגימות נדרשות. עם השלמת התוכנית, להסיר את השבב ואת האטם. השתמש pipette רב ערוצי ולהעביר 100 μL של אמולסיות לצינור PCR נקי. ודא שלכל באר יש צבע לבן אחיד המציין שאירע אמולסיה מלאה. החלף כפפות, נקה את הצינורות והעבר את צינור ה- PCR למכונת PCR שיכולה לתמוך בתגובות 100 μL. הפעל את התוכנית: 53 °C (53 °F) למשך 45 דקות; 85 °C (5 דקות) ל-5 דקות. בסיום, לאחסן את הדגימות ב 4 °C (5 °F). בשלב זה, לעבד את התגובה על פי הוראות היצרן או לאחסן ב 4 °C (50 °F) במשך 3 ימים או -20 °C (70 °F) במשך שבוע אחד. לאחר 5 דקות ב 85 °C (85 °F), רוב הווירוסים עטופים יהיה מומת, להסיר את cDNA מן BSL-3 על פי הליך ההפעלה הרגיל ולבצע את ההכנות הספרייה במעבדה BSL-1.הערה: ניסוי זה צריך להתבצע כשלושה העתקים ביולוגיים (למשל, בשלושה ימים שונים) מכיוון שהיקף ההבחנה של כל סוג תא יכול להשתנות מעט בין כל ניסוי. ספריות הרצף המתקבלות יכולות להיות בעלות אינדקס שונה ולרצף יחד בריצת רצף אחת.