Anpassung gastrointestinaler Organoide für Pathogeninfektionen und Einzelzellsequenzierung unter Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3)

Menschliches Gewebe wurde aus Kolonresektions- oder Ileumbiopsien des Universitätsklinikums Heidelberg für das folgende Protokoll erhalten. Diese Studie wurde auf Empfehlung des Universitätsklinikums Heidelberg mit informierter schriftlicher Zustimmung aller Probanden gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Alle Proben wurden anonymisiert empfangen und gepflegt. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Heidelberg unter dem Protokoll S-443/2017 genehmigt. 1. Erhaltung und Weitergabe von Darm- und Dickdarmorganoiden VORSICHT: Menschliche Darmorganoide werden aus menschlichem Gewebe oder aus induzierten pluripotenten/embryonalen Stammzellen gewonnen, und als solche ist eine ethische Genehmigung erforderlich. Länderspezifische Vorschriften müssen befolgt werden. Menschliches Material wird im Allgemeinen nicht getestet und wird daher oft als BSL-2-Material betrachtet. In dem Land, in dem das Experiment stattfindet, müssen die richtigen Eindämmungsbedingungen bestätigt werden. Darm- und Dickdarmorganoide aus isolierten Geweben und/oder Biopsien unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden2 herstellen. Darüber hinaus finden sich weitere technische Details zur Herstellung von Organoiden aus patientenabgeleitetem Material oder aus iPS-Zellen in Lees et al. und Mahe et al.24,25. Sobald Organoidkulturen etabliert sind, befolgen Sie die unten beschriebene Spaltroutine, um Organoide auf Infektionen mit enterischen Krankheitserregern vorzubereiten. Säen Sie 20-100 Organoide in 50 μL 100% ECM-Lösung in 24-Well-Nicht-Gewebekultur-behandelten Platten. Fügen Sie 500 μL Wachstumsmedien (Tabelle 1) pro Vertiefung hinzu. Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage, indem Sie 250 μL der alten Medien entfernen und 250 μL der frischen Wachstumsmedien zu jeder Vertiefung hinzufügen. Erwärmen Sie das Medium auf Raumtemperatur, bevor Sie das Medium wechseln.VORSICHT: Kalte Medien verflüssigen die ECM-Lösung, die Organoide enthält. Passieren Sie die Organoide einmal pro Woche, wenn das Innere aufgrund der Ansammlung von toten Zellen dunkel zu werden beginnt. Ein Beispiel dafür finden Sie in Abbildung 2. Am Tag der Spaltung die ECM-Lösung von -20 °C entfernen und auf Eis auftauen. Legen Sie die neue leere Zellkulturplatte, die zur Aussaat der Organoide verwendet wird, nach der Spaltung bei 37 ° C auf (dies erfordert mindestens 1 h, um warm zu sein und könnte über Nacht erwärmt werden). Erwärmen Sie die Kulturmedien auf Raumtemperatur. Entfernen Sie das Wachstumsmedium mit einer P1000-Pipette und geben Sie 500 μL kalte 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 3 min in jede Vertiefung, um die ECM-Lösung teilweise zu verflüssigen und von der Platte zu dissoziieren. Um eine vollständige Unterbrechung der ECM-Lösung zu gewährleisten, verwenden Sie eine P1000-Pipette (auf 450 μL eingestellt). 10-mal nach oben und unten pipettieren, um PBS, ECM-Lösung und Organoide wieder aufzunehmen, die resuspendierten Organoide in ein 15 ml konisches Rohr zu übertragen und auf Eis zu legen. Sammeln Sie mehrere Vertiefungen der gleichen Organoide in demselben konischen Rohr. Wenn mehrere verschiedene Organoide (verschiedene Spender, verschiedene Abschnitte, unterschiedliche Vorbehandlung usw.) gleichzeitig gespalten werden, sammeln Sie sie in verschiedenen konischen Röhrchen. Halten Sie während des Sammelns die konischen Röhren auf Eis. Die Proben bei 500 x g für 5 min bei 4 °C drehen. Entfernen Sie das PBS vorsichtig mit einer Pipette, um das Organoidpellet am Boden zu erhalten. Vermeiden Sie die Verwendung eines Vakuumabfallsystems mit einer eingebauten Pipette, da das Pellet von Organoiden sehr locker ist und leicht abgesaugt werden kann, wenn das PBS zu schnell entfernt wird. 1 ml 0,05% Trypsin in das konische Röhrchen geben und Organoide resuspendieren, indem sie 10 Mal mit einer P1000-Pipette auf und ab pipettieren. Das konische Röhrchen, das Organoide enthält, bei 37 °C für 3 min inkubieren. Fügen Sie 2 ml DMEM / F12-Medien hinzu, die 10% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin enthalten, um die Verdauung zu stoppen, und resuspend, um die Organoide zu stören, indem Sie 10-mal mit einer P1000-Pipette auf und ab pipettieren. Die Proben bei 500 x g für 5 min bei 4 °C drehen. Konische Röhrchen aus der Zentrifuge entfernen und auf Eis lagern. Entfernen Sie Medien / Trypsin vorsichtig mit einer 5 ml Einwegpipette, um das Organoidpellet am Boden zu erhalten. Lassen Sie etwa 500 μL Medien stehen und entfernen Sie dieses mit einer P1000-Pipette. Sobald Das Medium/Trypsin aus allen konischen Röhrchen entfernt wurde, entfernen Sie die mit 24 Well-Nicht-Zellkultur behandelte Platte aus dem 37 °C-Inkubator und legen Sie sie unter die Zellkulturhaube. Geben Sie 100% ECM-Lösung (auf Eis gehalten) in das konische Rohr mit den gespaltenen Organoiden im Verhältnis 1: 3 zu 1: 5, abhängig von den Wachstumsgewohnheiten der einzelnen Spenderorganoide. (Zum Beispiel, wenn eine Vertiefung mit 20-100 Organoiden in einem 50 μL Tropfen ECM-Lösung durchgelassen wurde, resuspendieren Sie das Organoidpellet in 150-250 μL eiskalte ECM-Lösung.) Samen 50 μL ECM-Lösung/Organoid-Mischung pro Vertiefung der 24-Well-Nicht-Zellkultur-behandelten Platte, die auf 37 °C vorgewärmt wurde.HINWEIS: ECM-Lösung polymerisiert sehr schnell, sobald sie sich erwärmt hat. Halten Sie die ECM-Lösung während des Gebrauchs immer kalt (auf Eis gelagert). Wenn Organoide resuspendiert wurden, samen Sie sofort auf einer neuen Platte. Für Anfänger wird empfohlen, eine Schachtel Mit Pipettenspitzen bei -20 ° C aufzubewahren, um zusätzliche Zeit für die Aussaat zu haben. Inkubieren Sie die 24-Well-Platte bei 37 °C für 10-15 min, damit die ECM-Lösung polymerisieren kann. Nach der Polymerisation werden zu jeder Vertiefung 500 μL Wachstumsmedien (Tabelle 1)26 gegeben und die Organoide bei 37 °C inkubiert. Überprüfen Sie die Organoide täglich durch Mikroskopie. Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage wie in Schritt 1.4. 2. Vorbereitung von Organoiden in zwei Dimensionen (2D) für apikale Infektionen HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt, wie Darmorganoide als Monoschicht von Zellen in einer Zellkulturplatte ausgesät werden, um Darmepithelzellen von ihrer apikalen Seite aus zu infizieren. Verwenden Sie die 48-Well-Platte für die Sequenzierungsexperimente und den 8-Well-Glasbodenkammer-Objektträger, um die Infektion mit Immunfluoreszenzansätzen zu kontrollieren. Anbau und Erhaltung von Organoiden wie in Abschnitt 1 beschrieben. Bevor Sie Organoide in 2D aussäen, beschichten Sie die 48-Well-Platten und den 8-Well-Glasbodenkammer-Objektträger mit 200 μL 2,5% menschlichem Kollagen in Wasser pro Well für 1 h bei 37 ° C.HINWEIS: Darmorganoide werden am besten in 48-Well-Platten und in 8-Well-Glasbodenkammer-Objektträgern ausgesät. Die Erfahrung hat gezeigt, dass sie sich in 96-Well-Platten nicht gut infizieren. Transwell-Einsätze können auch verwendet werden, um sowohl eine apikale als auch eine basolaterale Infektion in 2D zu ermöglichen. Wenn Transwells verwendet werden, überwachen Sie den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) vor der Infektion, um eine konfluente Monoschicht zu bestätigen. Normalerweise haben Darmorganoide eine enge Barriere mit einem TEER von 450-600Ohm/cm2. Säen Sie 100-150 Organoide in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte oder für eine Vertiefung eines 8-Well-Glasbodenkammer-Objektträgers. Um die Anzahl der Organoide zu schätzen, zählen Sie die Anzahl der Organoide, die in den 50 μL ECM-Lösungstropfen der in Abschnitt 1 hergestellten 24-Well-Platte vorhanden sind. Im Durchschnitt werden 1-2 Bohrlöcher benötigt, die ungefähr 15.000-30.000 Zellen ergeben. Um die ECM-Lösung zu unterbrechen und die Organoide zu versuchen, führen Sie die Schritte 1.8-1.17 aus. Entfernen Sie menschliches Kollagen von den 48-Well-Platten und dem 8-Well-Glasbodenkammer-Objektträger. Resuspendieren Sie das Organoidpellet im konischen Röhrchen in 250 μL Wachstumsmedium / Well und geben Sie die Mischung in die kollagenbeschichteten Vertiefungen. Legen Sie die Platte in einen 37 °C Inkubator.HINWEIS: Bei der Durchführung der Experimente werden mehrere Bedingungen verglichen (Mock vs. infizierte +/- Behandlung von Interesse). Um die Variabilität zwischen jeder Vertiefung von 2D-ausgesäten Organoiden zu minimieren, sammeln Sie die Gesamtzahl der notwendigen Organoide im selben konischen Rohr. Das Sammeln von Organoiden aus bis zu 12 Vertiefungen einer 24-Well-Platte kann 1 ml Trypsin und 2 ml neutralisierende Medien verwenden. Wenn Sie 12-24 Vertiefungen verwenden, erhöhen Sie dies auf 2 ml Trypsin und 4 ml neutralisierende Medien. Nach 48 h entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie in die Zellkulturhaube. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und ersetzen Sie es durch 250 μL pro Vertiefung Differenzierungsmedium (Tabelle 1). Wiederholen Sie diesen Medienwechsel 48 h später. Bestätigen Sie nach 48 h die Differenzierung (vier Tage nach dem Wechsel zu Differenzierungsmedien), indem Sie RNA extrahieren, cDNA mit 250 ng RNA herstellen und eine SYBR green based qPCR unter Verwendung von Primern für Stammzellen (OLFM4 und / oder SMOC2), Kelchzellen (MUC2), enteroendokrine Zellen (CHGA) und Enterozyten (SI und / oder CYP3A4) durchführen (Abbildung 3).HINWEIS: Beim Wechsel von Wachstumsmedien zu Differenzierungsmedien verringern Organoide ihre Expression von Stammzellmarkern (OLFM4 und/oder SMOC2) und erhöhen die Expression von Becherzellen (MUC2), enteroendokrinen Zellen (CHGA) und Enterozyten (SI und/oder CYP3A4) Markern durch qPCR. Bereiten Sie ein extra gut vor und pflegen Sie es mit Wachstumsmedien, um das Expressionsniveau jedes zelltypspezifischen Markers in Wachstums- und Differenzierungsmedien zu vergleichen. Bei Bestätigung der Differenzierung sind die Organoide bereit für eine apikale Infektion. Verschieben Sie die Organoide in die Biosicherheitsstufe, die für den Erreger der Wahl erforderlich ist.VORSICHT: Beachten Sie die lokalen Vorschriften und Standardarbeitsanweisungen des Instituts beim Umgang mit Krankheitserregern unter BSL-2- oder BSL-3-Containment. Um die in 2D gezüchteten Darmorganoide von ihrer apikalen Seite zu infizieren, entfernen Sie die Medien mit einer P1000-Pipette und fügen Sie pathogen hinzu, der bei der für das Experiment erforderlichen Vielzahl von Infektionen in Differenzierungsmedien verdünnt ist (das Mindestvolumen des Pathogen/Medien-Mix beträgt 50 μL pro Vertiefung und das maximale Volumen beträgt 250 μL pro Vertiefung). Lassen Sie die Infektion für 2 h bei 37 °C entweder mit einem Wipptisch im Zellkultur-Inkubator oder durch manuelles Schaukeln der Platte alle 15-20 min ablaufen. Optimieren Sie diese Zeit basierend auf dem Erreger Ihrer Wahl. Entfernen Sie das Medium nach 2 h mit einer P1000-Pipette und ersetzen Sie es durch 250 μL pro Vertiefung frischer Differenzierungsmedien. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C bis zum Zeitpunkt der Einzelzellsequenzierung. Um Zellen für die Einzelzellsequenzierung vorzubereiten, fahren Sie mit Abschnitt 4 fort. 3. Herstellung von Organoiden in drei Dimensionen (3D) für apikale und basolaterale Infektionen Züchten Sie Organoide wie in Abschnitt 1 beschrieben in einer mit 24 Well, nicht mit Zellkultur behandelten Platte. Entfernen Sie die Platte zwei Tage nach dem Passieren aus dem Inkubator und legen Sie sie in eine Zellkulturhaube. Entfernen Sie das Wachstumsmedium mit einer P1000-Pipette, ersetzen Sie es durch 500 μL/Well differenziertes Differenzierungsmedium, das auf Raumtemperatur vorgewärmt wurde, und legen Sie die Platte in den 37 °C-Inkubator. Nach 48 h durch frisches Differenzierungsmedium (500 μL/Well) ersetzen.HINWEIS: Organoide werden insgesamt 4 Tage vor der Infektion in Differenzierungsmedien gehalten. Bestätigen Sie die Differenzierung wie in Schritt 2.9 beschrieben. Nach Bestätigung, dass eine Differenzierung stattgefunden hat, sind Organoide bereit für eine Infektion. ECM auf Eis auftauen. Erwärmen Sie die Differenzierungsmedien auf Raumtemperatur und erwärmen Sie eine 24-Well-Platte bei 37 °C. Um Infektionen durchzuführen, entfernen Sie die Organoide aus der ECM-Lösung.HINWEIS: Entfernen Sie so viel ECM-Lösung wie möglich, da Viren es vorziehen, sich an die ECM-Lösung und nicht an Zellen zu halten. Wenn zu viel ECM-Lösung um die Organoide herum verbleibt, wird die Infektiosität stark beeinträchtigt. Unterbrechen Sie das ECM, indem Sie 500 μL kalte 1x PBS hinzufügen und 3 Minuten lang inkubieren. Verwenden Sie einen P1000, um 10x nach oben und unten zu pipettieren. Organoide in einem Röhrchen kombinieren und 5 min mit 500 x g zentrifugieren. Entfernen Sie PBS mit einem P1000.HINWEIS: Um die Variabilität zwischen den einzelnen Infektionszuständen zu minimieren, kombinieren Sie die Organoide, die aus mehreren Vertiefungen einer 24-Well-Platte stammen, in demselben konischen Rohr. Wenn beispielsweise acht Bedingungen für eine Infektion erforderlich sind, werden acht Vertiefungen einer 24-Well-Platte (die jeweils ~ 100 Organoide enthält) kombiniert und anschließend nach einer Nadelzerstörung in acht Vertiefungen einer neuen 24-Well-Platte aufgeteilt (siehe Schritt 3.12). Resuspendieren Sie die Organoide in 1 ml Differenzierungsmedium. Für apikale und basolaterale Infektionen folgen Sie Schritt 3.10.1 und für basolaterale Infektionen nur Schritt 3.10.2. Befestigen Sie eine 27 G-Nadel an einer 1-ml-Spritze und resuspen sie das Pellet sechsmal, um eine Störung der Organoide und eine Infektion sowohl an der apikalen als auch an der basolateralen Seite zu ermöglichen. Fahren Sie mit Schritt 3.11 fort.HINWEIS: Die Organoide sollten die klassischen zystenartigen und oktopusknospenförmigen Organoide mit einem dunklen Zentrum sein, wenn sie vor der Nadelstörung beobachtet werden. Nach der Störung erscheinen diese Organoide kleiner mit weniger bis gar keinem dunklen Inneren. Bei der Durchführung einer Infektion gibt es immer mindestens zwei Bedingungen (Mock und Infektion), mindestens zwei Vertiefungen einer 24-Well-Platte werden zunächst zu einem konischen 15-ml-Röhrchen für nadelbasierte Störungen kombiniert (was erklärt, warum mindestens 1 ml für die Resuspension verwendet wird). Wenn sie mehr als zwei Bedingungen erfüllen, kombinieren Sie bis zu 10 Vertiefungen einer 24-Well-Platte in einem einzigen konischen 15-ml-Rohr und resuspendieren Sie in 1 ml Differenzierungsmedien für Nadelunterbrechungen. Fügen Sie nach der Unterbrechung 500 μL Differenzierungsmedien pro n + 1 hinzu (z. B. wenn Sie 10 Vertiefungen verwenden, dann füllen Sie 4,5 ml auf, um insgesamt 5,5 ml zu erhalten). Wenn mehr als 10 Bedingungen erforderlich sind, verwenden Sie mehrere konische Rohre. Eine 1-ml-Spritze wird empfohlen, da die Organoide mit diesem Volumen der Spritze besser gestört werden. Eine Alternative zu einer Spritze ist die Verwendung einer gut abgeflachten P1000-Spitze. Resuspendieren Sie die Organoide in 500 μL Differenzierungsmedien pro Vertiefung. Achten Sie darauf, die Organoide nicht zu stören und stellen Sie sicher, dass die apikale Seite nicht zugänglich ist. Fahren Sie mit Schritt 3.11 fort. Übertragen Sie 500 μL Organoidsuspensionen pro Vertiefung mit einer P1000-Pipette auf eine Zellkulturplatte mit 24 Well und bringen Sie die Platte in die für den Erreger der Wahl erforderliche Sicherheitsstufe.VORSICHT: Beachten Sie die lokalen Vorschriften und die Standardarbeitsanweisungen des Instituts beim Umgang mit Krankheitserregern unter BSL-2- oder BSL-3-Eindämmung. Führen Sie immer die Nadelzerstörung der Organoide außerhalb des BSL-3 durch, um mögliche Unfälle mit der Nadel zu vermeiden. Lokale Vorschriften können auch die Verwendung von Nadeln im BSL-3 verhindern. Fügen Sie den in Differenzierungsmedien verdünnten Erreger hinzu, um die für das Experiment erforderliche Vielzahl von Infektionen zu erreichen. Überschreiten Sie nicht ein Gesamtvolumen von 500 μL (um insgesamt 1 ml in der 24-Well-Platte zu haben). Lassen Sie die Infektion 2 h (dieses Mal muss an den Erreger der Wahl angepasst werden) bei 37 °C entweder mit einem Wipptisch im Zellkultur-Inkubator oder durch manuelles Schaukeln der Platte alle 15-20 Min. Nach der 2-stündigen Inkubation werden die Organoide in einem 1,5-ml-Röhrchen pro Zustand gesammelt und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C gedreht. Entfernen Sie das erregerhaltige Medium mit einer P1000-Pipette und lagern Sie es auf Eis. Waschen Sie das Organoid-Pellet einmal mit PBS. Resuspendieren Sie die Organoide in 50 μL 100% ECM-Lösung (die zuvor auf Eis aufgetaut wurde), platten Sie sie in eine 24-Well-Nicht-Zellkultur-behandelte Platte, die auf 37 ° C vorgewärmt wurde, und inkubieren Sie die 24-Well-Platte bei 37 ° C für 10-15 min, damit die ECM-Lösung polymerisieren kann. Nach der Polymerisation 500 μL Differenzierungsmedien bei Raumtemperatur in jede Vertiefung geben und bei 37 °C inkubieren, bis sie für die Einzelzellsequenzierung geerntet werden.HINWEIS: Wenn die Ernte mehr als 48 h nach der Aussaat erfolgen muss, wechseln Sie das Medium alle 2 Tage, indem Sie das alte Medium entfernen und durch 500 μL frische Differenzierungsmedien ersetzen. Die Erfahrung hat jedoch gezeigt, dass Organoide, da sie unter Differenzierungsmedien gezüchtet werden, nicht viel länger als 48 h überleben werden. 4. Herstellung von Einzelzelllösung und Herstellung von Gelperlen-in-Emulsion (GEMs) unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) HINWEIS: Die Durchführung der folgenden Schritte erfordert, dass die Einzelzellsequenzierungsausrüstung (Materialtabelle) und eine PCR-Maschine, die 100 μL-Reaktionen verarbeiten kann, in einer BSL-3-Anlage vorhanden sind. Organoide werden wie in Abschnitt 1 beschrieben gezüchtet und je nach Erreger und Eintrittsweg wie in den Abschnitten 2-3 beschrieben infiziert. Zu einem vorbestimmten Zeitpunkt nach der Infektion werden Organoide geerntet. Im Folgenden wird die Methode zur Entnahme von Darmorganoiden beschrieben. Vor der Entnahme infizierter Organoide die Einzelzellgelperlen (Table of Materials) von -80 °C entfernen und auf Raumtemperatur erwärmen (mindestens 30 min vorher). Zusätzlich wird das RT-Reagenz, das Reduktionsmittel B und das RT-Enzym C (alle bei -20 °C gelagert) auf Raumtemperatur ausgeglichen. Resuspendieren Sie das Template-Schalter-Oligo wie in der Anleitung des Herstellers beschrieben.HINWEIS: Alle folgenden Schritte müssen in Bezug auf die lokalen Biosicherheitsvorschriften gemäß dem festgelegten Standardarbeitsverfahren für den betrachteten Erreger durchgeführt werden. Als Faustregel für BSL-3-Arbeiten muss sichergestellt werden, dass die Außenseite aller Gefäße (Platten, Röhrchen usw.), die aus einer Zellkulturhaube austreten, ordnungsgemäß desinfiziert werden. Gleiches gilt für die Hände/Handschuhe der Person, die die Experimente durchführt. Um Infektionen an Organoiden durchzuführen, die in 2D ausgesät wurden (Abschnitt 2), fahren Sie mit Schritt 4.4 fort. Um Infektionen an 3D-Organoiden durchzuführen (Abschnitt 3), fahren Sie mit Abschnitt 4.5 fort. Bei Infektionen von 2D-Organoiden die Zellkulturplatte in die Haube bringen und das Differenzierungsmedium mit einer P1000-Pipette entfernen. Fügen Sie 250 μL 1x PBS bei Raumtemperatur zu jeder Vertiefung hinzu. Entfernen Sie das PBS mit einer P1000-Pipette und geben Sie 250 μL Dissoziationsenzym bei Raumtemperatur (z. B. TrypLE Express) zu jeder Vertiefung einer 48-Well-Platte hinzu. Wechseln Sie die Handschuhe, reinigen Sie die Platte und legen Sie die Platte mit dem Dissoziationsenzym in den 37 °C-Inkubator. Beobachten Sie die Zelldissoziation durch Mikroskopie alle 5 Minuten.HINWEIS: Ungefähr dauert es 15 Minuten, um intestinale Organoide, die in 2D kultiviert wurden, in einzelne Zellen zu dissoziieren. Diese Zeit muss angepasst werden, da sie davon abhängt, wie viele Organoide ursprünglich ausgesät und infiziert wurden, sowie vom Erreger, da einige Krankheitserreger zytopathischer sind und dazu führen, dass Organoide viel schneller dissoziieren als andere. Nach Bestätigung einer scheinbaren Einzelzellsuspension bringen Sie die Platte zurück in die Zellkulturhaube und stoppen Sie den Aufschluss durch Zugabe von 250 μL DMEM/F12-Medien, die 10% FBS pro Vertiefung einer 48-Well-Platte enthalten. Sammeln Sie die Zellen in einem 15 ml konischen Rohr mit einer P1000 Pipette. Wechseln Sie die Handschuhe, reinigen Sie das Röhrchen und drehen Sie die Proben bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig das Medien- / Dissoziationsenzym mit einem P1000, um das Zellpellet am Boden zu erhalten. Resuspend einzelne Zellen in einem minimalen Volumen von PBS mit 0,1% BSA. Für Darmorganoide resuspend in 250 μL für jede Vertiefung der 48-Well-Platte. Geben Sie die Zellsuspensionen in ein FACS-Röhrchen mit einem Filter, um große Klumpen zu entfernen, und legen Sie das FACS-Röhrchen, das Zellen enthält, auf Eis. Fahren Sie mit Schritt 4.6 fort, um mit der Zellzählung und der Vorbereitung des Master-Mixes fortzufahren. Bei Infektionen mit 3D-Organoiden entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie in die Zellkulturhaube. Entfernen Sie das Differenzierungsmedium aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte mit einer P1000-Pipette. Fügen Sie 500 μL eiskaltes 1x PBS zu jedem Bohrloch hinzu und inkubieren Sie für 3 min auf Eis. Um eine vollständige Unterbrechung der ECM-Lösung zu gewährleisten, verwenden Sie eine P1000-Pipette (eingestellt auf 450 μL). 10-mal nach oben und unten pipettieren, um pbS, ECM-Lösung und Organoide wieder aufzunehmen; die resuspendierten Organoide in ein 15 ml großes konisches Rohr geben und auf Eis legen. Sammeln Sie jeden Infektionszustand in einem eigenen 15 ml konischen Rohr.HINWEIS: Die Verwendung eines konischen 15-ml-Rohrs ergibt ein besseres, deutlicheres Zellpellet als ein 50-ml-konisches Rohr oder ein 1,5-ml-Rohr. Wechseln Sie die Handschuhe und entfernen Sie die Tube von der Zellkulturhaube. Reinigen Sie die Außenseite des Röhrchens. Die Proben bei 500 x g für 5 min bei 4 °C drehen. Bewegen Sie das Röhrchen zurück in die Zellkulturhaube und entfernen Sie PBS mit einer P1000-Pipette, um zu vermeiden, dass das Organoid-Pellet vom Boden des Röhrchens wiederverwendet wird. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Dissoziationsenzym (z. B. TrypLE Express). Wechseln Sie die Handschuhe, reinigen Sie das Röhrchen und inkubieren Sie die Proben bei 37 °C. Bewegen Sie das Röhrchen alle 10 Minuten für 30 Minuten zurück in die Zellkulturhaube und resuspenieren Sie die Organoide, indem Sie mit einer P1000-Pipette 10 Mal auf und ab pipettieren.HINWEIS: Normalerweise benötigen Darmorganoide etwa 30 Minuten, um eine Einzelzellsuspension zu bilden, wenn sie in 3D infiziert werden. Um festzustellen, wann Organoide zu einzelnen Zellen dissoziiert werden, nehmen Sie 10 μL der Organoidsuspension mit einer p10-Pipette. Legen Sie die Suspension in einen Einweg-Kunststoffzellen-Gegenträger. Versiegeln Sie den Probeneingang mit durchsichtigem Klebeband. Wechseln Sie die Handschuhe und reinigen Sie die Außenseite des Zellenzählers. Verwenden Sie ein Hellfeldmikroskop, um festzustellen, ob eine einzelne Zellsuspension hergestellt wird. Nach Bestätigung einer Einzelzellsuspension stoppen Sie den Aufschluss durch Zugabe von 1 ml DMEM/F12-Medien mit 10% FBS und Pipette 10 Mal mit einer P1000-Pipette. Wechseln Sie die Handschuhe, reinigen Sie das Röhrchen und drehen Sie die Proben bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie das Medien-/Dissoziationsenzym vorsichtig mit einer P1000-Pipette, um zu vermeiden, dass das Zellpellet vom Boden des Röhrchens wiederverwendet wird. Resuspendieren Sie die einzelnen Zellen in einem minimalen Volumen von PBS, das 0,1% BSA enthält. Für intestinale Organoide resuspend in 250 μL. Geben Sie die Zellsuspensionen in ein FACS-Röhrchen mit einem Filter, um große Klumpen zu entfernen, und legen Sie das FACS-Röhrchen, das Zellen enthält, auf Eis. Fahren Sie mit Schritt 4.6 fort, um mit der Zellzählung und der Vorbereitung des Master-Mixes fortzufahren. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro μL, indem Sie 10 μL der Zellsuspension in eine Einweg-Plastikzellzählkammer geben. Verschließen Sie den Probeneingangsanschluss mit durchsichtigem Klebeband, bevor Sie die Probe aus der Zellkulturhaube entnehmen, da die Zellsuspension in diesem Stadium noch infektiös ist. Wechseln Sie die Handschuhe, reinigen Sie die Zellzählkammer und zählen Sie die Zellzahl mit einem Hellfeldmikroskop. Bereiten Sie in der Zellkulturhaube eine Mastermischung aus RT-Reagenz, Template Switch Oligo, Reducing Agent B und RT-Enzym C in einem 1,5-ml-Röhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, abhängig von der Anzahl der Proben im Experiment. Für jede Probe aliquot 33,4 μL Mastermischung in ein PCR-Röhrchen geben und auf Eis lagern. Fügen Sie die Zellen und das Wasser gemäß der Zielzellnummer, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben, in die Mastermischung ein.HINWEIS: 50%-60% der Zellen werden normalerweise zurückgewonnen (d.h. beim Laden von 10.000 Zellen auf den Chip werden 5.000-6.000 Zellen für die Analyse verwendet). Laden Sie daher immer 10.000 Zellen ein. Wenn die Zelldichte dies nicht zulässt, zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie in einem niedrigeren Volumen. Achten Sie darauf, den Chip nicht zu überladen, da dies zu einer Verstopfung des Chips führt. Wenn Zellen nicht richtig dissoziiert werden, besteht außerdem ein erhöhtes Risiko, mehrere Zellen pro Perle zu erhalten, die in der nachgelagerten bioinformatischen Verarbeitung entfernt werden müssen. Wechseln Sie die Handschuhe, bewegen Sie den Einzelzellen-Controller in die Zellkulturhaube und bereiten Sie den Chip vor, da der Chip nur mit einer Dichtung bedeckt ist, die nicht versiegelt ist.HINWEIS: Das Gerät muss sich in der Haube befinden, um eine Exposition gegenüber infizierten Zellsuspensionen und potenziellen Aerosolen zu vermeiden. Fügen Sie den Einzelzellchip zum Chiphalter hinzu und füllen Sie die unbenutzten Bahnen mit 50% Glycerin. Fügen Sie die Mastermischung, die Perlen und das Partitionierungsöl gemäß den Anweisungen des Herstellers zu den für Proben verwendeten Bahnen hinzu. Decken Sie den Chip mit der Dichtung ab, laden Sie den Chip in den Controller und starten Sie das Programm.HINWEIS: Es wird empfohlen, nur sechs der acht Fahrspuren zu laden. Probleme mit unsachgemäßen Emulsionen treten häufig in den Bahnen eins und acht auf. Das Unternehmen sagt, dass alle Fahrspuren unabhängig sind, und dies sollte nicht passieren; Wenn möglich, vermeiden Sie jedoch diese beiden Bahnen und lassen Sie zwei Chips laufen, wenn acht Proben benötigt werden. Entfernen Sie nach Abschluss des Programms den Chip und die Dichtung. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette und übertragen Sie 100 μL der Emulsionen in ein sauberes PCR-Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung eine gleichmäßige weiße Farbe aufweist, die anzeigt, dass eine vollständige Emulsion aufgetreten ist. Wechseln Sie die Handschuhe, reinigen Sie die Röhrchen und übertragen Sie das PCR-Röhrchen auf ein PCR-Gerät, das 100-μL-Reaktionen unterstützen kann. Führen Sie das Programm aus: 53 °C für 45 min; 85 °C für 5 Min. Nach Fertigstellung lagern Sie die Proben bei 4 °C. An dieser Stelle die Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers verarbeiten oder bei 4 °C für 3 Tage oder -20 °C für 1 Woche lagern. Nach 5 min bei 85 °C werden die meisten behüllten Viren inaktiviert, die cDNA gemäß dem normalen Betriebsverfahren aus dem BSL-3 entfernt und die Bibliotheksvorbereitungen in einem BSL-1-Labor durchgeführt.HINWEIS: Dieses Experiment muss als drei biologische Replikate (z. B. an drei verschiedenen Tagen) durchgeführt werden, da das Ausmaß der Differenzierung jedes Zelltyps zwischen jedem Experiment leicht variieren kann. Die resultierenden Sequenzierungsbibliotheken könnten in einem Sequenzierungslauf unterschiedlich indiziert und sequenziert werden.