Målet med metoden är att screena för hypertermi eller värmeinducerade anfall i musmodeller. Protokollet beskriver användningen av en specialbyggd kammare med kontinuerlig övervakning av kroppstemperaturen för att avgöra om förhöjd kroppstemperatur leder till anfall.
Transgena musmodeller har visat sig vara kraftfulla verktyg för att studera olika aspekter av mänskliga neurologiska störningar, inklusive epilepsi. SCN1A-associerade genetiska epilepsies består av ett brett spektrum av beslag störningar med ofullständig penetrance och klinisk variabilitet. SCN1A mutationer kan resultera i en stor variation av beslag fenotyp allt från enkel, självbegränsad feber-associerade febrile beslag (FS), måttlig nivå genetisk epilepsi med febrile beslag plus (GEFS +) till allvarligare Dravet syndrom (DS). Även om FS ofta ses hos barn under 6-7 år som inte har genetisk epilepsi, fortsätter FS i GEFS + patienter att uppstå i vuxen ålder. Traditionellt har experimentella FS inducerats hos möss genom att utsätta djuret för en ström av torr luft eller värmelampor, och förändringshastigheten i kroppstemperaturen är ofta inte väl kontrollerad. Här beskriver vi en specialbyggd värmekammare, med plexiglasfront, som är utrustad med en digital temperaturregulator och en värmeutrustad elektrisk fläkt, som kan skicka uppvärmd forcerad luft till testarenan på ett temperaturstyrt sätt. Kroppstemperaturen hos en mus som placeras i kammaren, övervakad genom en rektal sond, kan ökas till 40-42 °C på ett reproducerbart sätt genom att öka temperaturen inuti kammaren. Kontinuerlig visuell övervakning av djuren under uppvärmningsperioden visar induktion av värmeinducerade anfall hos möss som bär en FS-mutation vid en kroppstemperatur som inte framkallar beteendemässiga anfall hos vilda kullkamrater. Djur kan enkelt avlägsnas från kammaren och placeras på en kylplatta för att snabbt återställa kroppstemperaturen till det normala. Denna metod ger en enkel, snabb och reproducerbar screening protokoll för förekomsten av värme-inducerade beslag i epilepsi mus modeller.
Epilepsi, den fjärde vanligaste familjen av neurologiska störningar i USA1, kännetecknas av en obalans av excitatorisk och hämmande enhet i CNS som leder till återkommande anfall. Feberkramper (FS) eller feberassocierade anfall kan förekomma i den allmänna befolkningen, oftast hos barn så tidigt som 3 månader upp till 6-7 år. Men hos vissa individer med genetiska mutationer, oftast i en natriumkanalgen, kan FS kvarstå efter 7 års ålder in i vuxen ålder. Detta tillstånd kallas feberkramper plus eller FS+. Snabba framsteg inom genomsekvensering har identifierat över 1 300 mutationer i den mänskliga natriumjonkanalgenen SCN1A, vilket gör den till en hotspot för epilepsimutationer. SCN1A mutationer har kopplats till ett brett spektrum av beslag störningar, inklusive febrile beslag (FS), genetisk epilepsi med febrile beslag plus (GEFS +) och Dravet syndrom (DS)2,3,4,5,6. Cirka 20% av SCN1A missense mutationer leder till GEFS +5,7,8. Pediatrisk historia av komplexa eller långvariga FS i barndomen kan därefter utvecklas till mer försvagande former av epilepsi såsom temporala lob epilepsi (TLE)9,10,11. Dravets syndrom uppstår på grund av trunkationsmutationer eller förlust av funktionsmutationer i SCN1A och är en allvarlig form av svårbehandlad epilepsi, med barndomens uppkomst av feberkramper som utvecklas till eldfasta anfall och är ofta förknippad med kognitiva, utvecklingsmässiga och motoriska funktionsnedsättningar2,5 12 . Eftersom många individer med GEFS + och/eller DS uppvisar febrile beslag, blir det absolut nödvändigt att utveckla nya terapier för att bättre bekämpa dessa beslag störningar.
Djurmodeller av SCN1A associerade epilepsi har visat sig ovärderliga för att karakterisera olika typer av anfall (febrile vs generalized) och dissekera den neuronala mekanismen för beslag generation13,14,15,16,17,18. Medan studien av spontana anfall via EEG/EMG-inspelningar i gnagarehjärnor är väletablerad och är ett mycket användbart verktyg, har endast ett fåtal studier försökt efterlikna feberkramper i musmodeller14,16,19,20,21,22,23 . Tidigare studier har använt en stråle av uppvärmd torr luft, eller en metakrylatcylinder utrustad med ett termiskt system, eller värmelampor med temperaturregulator i slutna testarenor9,16,21,22,23,24 för att inducera anfall via hypertermi. För att öka kroppstemperaturen i en mer kontrollerad miljö använder protokollet som beskrivs här en specialbyggd kammare med ett temperaturstyrt värmesystem som tillät reproducerbara ökningshastigheter i kroppstemperaturen hos en mus inuti kammaren. Värmekammaren är tillverkad av trä (längd 40 cm x bredd 34 cm x höjd 31 cm) och var utrustad med en digital temperaturregulator med en K termoelement. En liten axiell fläkt utrustad med en värmare på kammarens bakpanel leder uppvärmd luft in i kammaren som regleras av en digital temperaturregulator. Detta påtvingade luftuppvärmningssystem gör det möjligt att styra hastigheten med vilken kammartemperaturen ökar. (Figur 1A,B). K-termoelementet inuti trävärmekammaren skickar återkoppling till den digitala temperaturregulatorn för att bibehålla konstanta temperaturer inuti lådan under analysen. Genom att ställa in temperaturen på den digitala temperaturregulatorn kan den elektriska fläkten skicka uppvärmd forcerad luft genom ventiler för att värma kammaren jämnt (figur 1A). Värmekammarens frontpanel är ett tydligt plexiglasark för att möjliggöra enkel videoinspelning av försöken.
Vuxna (P30-P40) möss, heterozygous för en missense mutation i SCN1A som orsakar GEFS + och ett lika antal vilda-typ kull mates att fungera som kontrollgrupp, valdes för varje experiment. Djur, både hanar och kvinnor, som användes i dessa studier vägde minst 15 g eftersom möss av vildtyp som vägde mindre var mer känsliga för värmeinducerade anfall än tyngre djur i samma ålder. I pilotstudien observerades både muterade möss av vildtyp och möss av vild typ för att söka efter de svalare hörnen av kammaren på baksidan och stannade där under längre tidsperioder. För att kringgå detta reducerades den effektiva golvstorleken inuti värmekammarens testarena till längd 16,5 cm x bredd 21,5 cm x höjd 27,5 cm genom att placera ett träblock B (måtten 20 cm x 8 cm x 7,2 cm) på kammarens högra sida (figur 1A). Värmekammaren är tillverkad av 1,9 cm tjock plywood (längd 40 cm x bredd 34 cm x höjd 31 cm) täckt med vitt laminat och utrustad med en digital temperaturregulator med en K-termoelement. Kammarväggarnas laminatyta är ogenomtränglig och kan lätt saneras mellan försök genom att torka av med 70% etanol. Temperaturen i värmekammaren sattes ursprungligen till 50 °C och förvärmdes i minst 1 h före försökets början, för att säkerställa enhetlig uppvärmning inuti kammaren. Varje mus var utrustad med en rektaltermometer för kontinuerlig övervakning av kroppstemperaturen under hela experimentet. En enda mus placerades i kammaren åt gången och temperaturen hölls vid 50 °C mellan 1:a och 10:e minuten. Temperaturen höjdes sedan till 55 °C för 11-20:e minuten och höjdes slutligen till 60 °C i 21-30:e minuten. Detta resulterade i en reproducerbar ökningshastighet i musens kroppstemperatur (figur 2A). Varje studie var videotejpad och beteendeanalys utfördes offline.
Värmeprotokollet kan enkelt ändras för att ändra värmekammarens ursprungliga temperatur och den hastighet som kammaren värms upp, vilket i sin tur ändrar hur snabbt musens kroppstemperatur höjs under analysen. Således ger denna metod mer flexibilitet över traditionella metoder för att ställa in beteendemässiga skärmar som involverar värmeinducerade anfall. Det värmeinducerade anfallsprotokollet kan också användas för att screena för antiepileptika som gör muterade möss mer resistenta mot värmeinducerade anfall eller ökar den tröskeltemperatur vid vilken anfall observeras. På samma sätt kan positiva effekter av restriktiva dietregimer som ketodiet på värmeinducerade anfall undersökas i normala chow-matade vs ketomatade möss.
Bild 1: Beskrivning av den specialbyggda musvärmekammaren. (A) Frontpanelen i trämusvärmekammaren visar sidokontrollpanelen som innehåller Power ON/OFF-strömbrytare som slår på digital temperaturregulator, K termoelement, värmefläktens ON/OFF-strömbrytare och värmeindikator. Lådans yttre dimensioner och den inre testarenan visas i cm. Ett träblock B som används för att effektivt minska testarenans yta visas också. Botten av testarenan är täckt med cob sängkläder för att förhindra möss från direkt komma i kontakt med uppvärmda träytor. (B) Värmekammarens baksida visar fläkten monterad på den övre luftventilen och nätsladden för att leverera el till kammaren. Denna siffra ändras från figur 3 i Das et al., 2021, eNeuro14. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Vi beskriver ett enkelt och effektivt protokoll för att screena för förekomst av värme-inducerade beslag hos möss, beteendemässiga motsvarigheten till febrile beslag hos mänskliga patienter. Analysen utvärderar flera parametrar – inklusive andelen möss som visar anfall, anfallströskel, svårighetsgraden av anfall på en Racine-skala, för att jämföra känsligheten hos kontroll- och testmössgrupper med ökningar av kroppstemperaturen.
Ett kritiskt steg i detta protokoll innebär att öka värmen i kammaren samtidigt som man kontinuerligt övervakar musens kroppstemperatur. Det är absolut nödvändigt att den maximala kroppstemperaturen som mössen kommer att uppleva i dessa analyser är 44 °C eftersom vilda djur kan genomgå värmeinducerade anfall vid kroppstemperaturer >44 °C. Förbehandling med generell anestesi eller smärtstillande medel kan minska djurens kroppstemperatur eller störa termoreguleringen, vilket i sin tur skulle förvirra insamlingen av temperaturdata för anfallströskeln. Möss enligt detta screeningprotokoll kunde således inte förses med dessa medel under 30 minuters försöksfönster. Alla förfaranden måste godkännas av institutionens IACUC-kommitté. För att säkerställa kontinuerlig övervakning av musens kärntemperatur under analysen, tejpa säkert rektaltemperatursonden på mössens svans. Om musens kroppstemperatur under analysen visar sig vara oförändrad under längre tidsperioder även efter att muskammarens temperatur har ökat, se till att rektaltemperatursonden inte har kommit ut ur musen eller är fastsatt löst på svansen.
Genetisk bakgrund av musmodeller kan påverka känsligheten för SCN1A mutationen och farmakologiskt inducerad beslag18,25,26,27. Som diskuteras i resultaten ovan kan mössens genetiska bakgrund påverka deras mottaglighet för värmeinducerade anfall. Scn1a K1270T GEFS+ mutant möss testades i två genetiska bakgrunder – 129X1 och B6NJ, och en liten andel vilda möss (33%) i beslag känsliga B6NJ bakgrund, observerades också att genomgå värme-inducerade beslag. I jämförelse med heterozygous mutant Scn1aKT/+ möss upplevde dock B6NJ vilda möss värmeinducerade anfall vid en betydligt högre temperaturtröskel. Detta bekräftar att den genetiska mutationen (Scn1a K1270T) som introducerades av CRISPR knock-in gör mutanta möss mer mottagliga för hypertermi-inducerade anfall.
Det finns flera fördelar med att anta detta protokoll, som sammanfattas nedan. För det första, till skillnad från användningen av ström av torr luft eller uppvärmda lampor, ger en temperaturstyrd forcerad luft som ställts upp inom ett slutet utrymme experimenteraren mer kontroll över uppvärmningen av testarenan i önskad takt. Stegen i värmeprotokollet kan enkelt modifieras för att öka/ minska starttemperaturen, varaktigheten för varje steg etc. för att screena äldre möss som är tyngre eller större gnagare som råttor. För det andra ger kontinuerlig övervakning av musens kroppstemperatur via den bifogade rektalsonden värdefull information om hastigheten på kroppstemperaturförändringen hos enskilda möss, under hela analysen. Detta gör det möjligt för experimenteraren att noga observera att temperaturförändringen i musen inte överstiger 0,25-0,5 °C/min (vilket kan vara stressande för djuren) när detta protokoll anpassas till andra testarenor. Viktigt är att förändringstakten av kroppstemperaturen över tiden i olika mössgrupper kan kasta ljus över deras förmåga att termoregulera och kan vara till hjälp för att förstå om febrile beslag som orsakar mutationer också förändra termoreguleringen hos möss. För det tredje säkerställer kontinuerlig övervakning av kroppstemperaturen att mätningarna av anfallströskeln med detta protokoll är korrekta, eftersom de registreras samtidigt med den första anfallsattacken som musen upplever. Om djurets kroppstemperatur inte övervakas kontinuerligt eller tröskeltemperaturen för anfall mäts efter att djuret har tagits ut ur testarenan, kan tröskelvärdena för anfall variera beroende på den tid det tar att hantera mössen efter anfallen. Slutligen kringgår denna metod behovet av att använda invasiva metoder för att inducera feber (genom att injicera patogener) hos möss för att efterlikna feberkramper hos mänskliga patienter.
En av begränsningarna i detta protokoll är att det är svårt att screena juvenila (mindre än P30 i ålder) möss för värmeinducerade anfall. Protokollet utvecklades för att screena för känslighet hos vuxna möss (P30-P40 och högre) till värme- eller hypertermi-inducerade anfall. Enligt vår erfarenhet är de yngre mössen av vildtyp, särskilt de som väger under 15 g, mer benägna att genomgå värmeinducerade anfall, vilket kan bero på underutvecklade termoreguleringsmekanismer, fysiologisk termisk stress eller en kombination av båda. Därför är det inte idealiskt att utföra den värmeinducerade anfallsskärmen på juvenila möss med hjälp av detta protokoll.
Framtida studier som kombinerar EEG-övervakning samtidigt som musen utsätts för värmeinducerade anfall kan kasta ljus över EEG-anfallsmönster av värmeinducerade anfall, liknande en tidigare studie19. Neuronal aktivitet i specifika områden i mushjärnan kan spåras genom att kombinera optogenetiska metoder och immunohistokemibaserade studier efter skörd av hjärnvävnaden. Effekterna av restriktiva dieter som ketodiet på att minska feberkramper kan också utvärderas genom att utsätta ketomatade möss och normala chow-matade möss för värmeinducerat anfallsprotokoll. På samma sätt kan epilepsiläkemedelsscreeningsparadigm utvecklas för att testa och identifiera läkemedelskandidater som lindrar eller undertrycker värmeinducerade anfall hos läkemedelsmatade eller behandlade möss jämfört med fordonsmatade eller kontrollmöss.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Connor J. Smith för hans hjälp med att bygga den anpassade musvärmekammaren. Vi bekräftar hjälpen från O’Dowd lab-medlemmar, Lisha Zeng och Andrew Salgado för att standardisera värmeprotokollet under de tidiga stadierna av analysutvecklingen. Vi tackar också Danny Benavides och Kumar Perinbam för videoinspelningsdelar av det experimentella förfarandet för manuskriptet. Detta arbete stöddes av NIH-bidraget (NS083009) som tilldelades D.O.D.
Axial fan | Farnam | AF20-200-120-xx10-3.1 | Farnam custom products -Axial Fan Heater with Fan |
Digital temperature controller | Inkbird | ITC-100RH | Inkbird digital PID temperature controller ITC-100RH with K thermocouple |
Mouse rectal temperature probe | ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc | RET-3 | Mouse rectal temperature probe with thermometer |