Expression de GFP induite par la lumière dans des embryons de poisson-zèbre à l’aide du système optogénétique TAEL/C120
Summary
L’optogénétique est un outil puissant avec de nombreuses applications. Ce protocole montre comment obtenir une expression génique inductible à la lumière chez les embryons de poisson-zèbre en utilisant le système TAEL/C120 sensible à la lumière bleue.
Abstract
Les systèmes d’expression génique inductibles sont un outil inestimable pour l’étude des processus biologiques. Les systèmes d’expression optogénétique peuvent fournir un contrôle précis sur le moment, l’emplacement et l’amplitude de l’expression des gènes en utilisant la lumière comme agent inducteur. Dans ce protocole, un système d’expression optogénétique est utilisé pour obtenir une expression génique inductible à la lumière chez les embryons de poisson-zèbre. Ce système repose sur un facteur de transcription conçu appelé TAEL basé sur un facteur de transcription naturel activé par la lumière de la bactérie E. litoralis. Lorsqu’il est éclairé par une lumière bleue, TAEL se dimérise, se lie à son élément régulateur apparenté appelé C120 et active la transcription. Ce protocole utilise des embryons transgéniques de poisson zèbre qui expriment le facteur de transcription TAEL sous le contrôle du promoteur ubb omniprésent. Dans le même temps, l’élément régulateur C120 entraîne l’expression d’un gène rapporteur fluorescent (GFP). En utilisant un simple panneau LED pour délivrer une lumière bleue activatrice, l’induction de l’expression GFP peut d’abord être détectée après 30 minutes d’éclairage et atteint un pic de plus de 130 fois l’induction après 3 h de traitement par la lumière. L’induction de l’expression peut être évaluée par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et par microscopie à fluorescence. Cette méthode est une approche polyvalente et facile à utiliser pour l’expression des gènes optogénétiques.
Introduction
Les systèmes d’expression génique inductibles aident à contrôler la quantité, le moment et l’emplacement de l’expression des gènes. Cependant, il a été difficile d’obtenir un contrôle spatial et temporel exact dans les organismes multicellulaires. Le contrôle temporel est le plus souvent obtenu par l’ajout de composés à petites molécules1 ou l’activation de promoteurs de choc thermique2. Pourtant, les deux approches sont vulnérables aux problèmes de timing, de force d’induction et de réponses au stress hors cible. Le contrôle spatial est principalement réalisé par l’utilisation de promoteurs spécifiques aux tissus 3 , maiscetteapproche nécessite un promoteur ou un élément régulateur approprié, qui ne sont pas toujours disponibles, et elle n’est pas propice à l’induction au niveau des sous-tissus.
Contrairement à ces approches conventionnelles, les activateurs transcriptionnels optogénétiques activés par la lumière ont le potentiel d’un contrôle spatial et temporel plus fin de l’expression des gènes4. Le système TAEL/C120 sensible à la lumière bleue a été développé et optimisé pour une utilisation dans les embryons de poisson zèbre5,6. Ce système est basé sur un facteur de transcription endogène activé par la lumière de la bactérie E. litoralis7,8. Le système TAEL/C120 se compose d’un activateur transcriptionnel appelé TAEL qui contient un domaine de transactivation Kal-TA4, un domaine LOV (détection lumière-oxygène-tension) sensible à la lumière bleue et un domaine de liaison à l’ADN HTH (helix-turn-helix)5. Lorsqu’ils sont éclairés, les domaines LOV subissent un changement conformationnel qui permet à deux molécules TAEL de se dimériser, de se lier à un promoteur C120 sensible au TAEL et d’initier la transcription d’un gène d’intérêt en aval5,8. Le système TAEL/C120 présente une induction rapide et robuste avec une toxicité minimale, et il peut être activé par plusieurs modalités de livraison de lumière différentes. Récemment, des améliorations ont été apportées au système TAEL/C120 en ajoutant un signal de localisation nucléaire au TAEL (TAEL-N) et en couplant l’élément régulateur C120 à un promoteur basal cFos (C120F)(Figure 1A). Ces modifications ont amélioré les niveaux d’induction de plus de 15 fois6.
Dans ce protocole, un simple panneau LED est utilisé pour activer le système TAEL/C120 et induire l’expression omniprésente d’un gène rapporteur, GFP. L’induction de l’expression peut être surveillée qualitativement en observant l’intensité de fluorescence ou quantitativement en mesurant les niveaux de transcription à l’aide de la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). Ce protocole démontrera le système TAEL/C120 comme un outil polyvalent et facile à utiliser qui permet une régulation robuste de l’expression des gènes in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit l’utilisation du système optogénétique TAEL/C120 pour obtenir une expression génique inductible à la lumière bleue. Ce système est constitué d’un activateur transcriptionnel, TAEL, qui dimérise lors de l’éclairage avec de la lumière bleue et active la transcription d’un gène d’intérêt en aval d’un élément régulateur C120. L’expression induite d’un rapporteur GFP peut être détectée après aussi peu que 30 minutes d’exposition à la lumière, ce qui suggère que ce…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Stefan Materna et les membres des laboratoires Woo et Materna pour leurs suggestions et commentaires utiles sur ce protocole. Nous remercions Anna Reade, Kevin Gardner et Laura Motta-Mena pour leurs précieuses discussions et idées lors de l’élaboration de ce protocole. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) et le Comité de coordination de la recherche sur le cancer de l’Université de Californie (CRN-20-636896) à S.W.
Materials
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
Referências
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