Transdução Transitória das Formas Estrofes estropidas de Echinococcus granulosus
Summary
Descrevemos uma técnica de transdução transitória rápida em diferentes estágios de desenvolvimento do Echinococcus granulosus usando vetores lentivirais de terceira geração.
Abstract
A echinocococose cística ou doença hídátida é uma das doenças parasitárias zoonóticas mais importantes causadas pelo Echinococcus granulosus, uma pequena tênia abrigada no intestino dos caninos. Há uma necessidade urgente de pesquisa genética aplicada para entender os mecanismos da patogênese e controle e prevenção de doenças. No entanto, a falta de um sistema de avaliação genética eficaz impede a interpretação direta da genética funcional dos parasitas cestode, incluindo as espécies de Echinococcus . O presente estudo demonstra o potencial da transdução transitória de genes lentiviral nas formas metacestode e estrobólicas de E. granulosus. Os protoscolés (PSCs) foram isolados de cistos de hidátíndicos e transferidos para meios específicos de cultura bifásica para se desenvolverem em vermes estrofiados. Os vermes foram transfectados com lentivírus de terceira geração colhidos, juntamente com células HEK293T como um controle de processo de transdução. Uma fluorescência pronunciada foi detectada nos vermes estroboscópicos ao longo de 24 h e 48 h, indicando transdução lentiviral transitória em E. granulosus. Este trabalho apresenta a primeira tentativa de transdução transitória baseada em lentivírus em tênias e demonstra os resultados promissores com potenciais implicações em estudos experimentais sobre biologia de vermes planos.
Introduction
A echinocococcose cística (CE) é uma das doenças helmintos mais importantes causadas pelo Echinococcus granulosus, uma pequena tênia dentro da família Taeniidae 1,2. Foram realizados estudos extensivos sobre o desenvolvimento de imunodiagnósticos e vacinas para e. granuloso. No entanto, o conhecimento inadequado sobre a base molecular da biologia dos parasitas apresenta grandes limitações no diagnóstico, manejo e prevenção da doença hídida 3,4,5,6.
Nos últimos anos, devido ao desenvolvimento de sequenciamento de genomas e métodos transcriptômicos, uma ampla gama de estudos moleculares têm sido realizados em flatworms por vários grupos de pesquisa 7,8,9. No entanto, no mundo dos parasitas, os avanços na tecnologia de transferência de genes em flatworms parasitas ainda são limitados em comparação com os métodos de transdução transitório altamente reprodutíveis desenvolvidos para alguns protozoários 10,11,12.
O uso de sistemas de entrega viral emergiu como uma ferramenta essencial para a entrega de transgenes e investigações de genes/proteínas nas últimas duas décadas13. O lentivírus infecta células divisórias e não-divisórias, possibilitando infectar células pós-médicos 14,15,16. Evidências recentes indicam que o uso de um sistema de transdução baseado em lentivírus em células de mamíferos oferece o potencial de superar a maioria das limitações das técnicas anteriores de knock-in/knock-down. O desenho e construção de vetores lentivirais de expressão com marcadores moleculares apropriados, como a expressão GFP, foram descritos anteriormente16. Portanto, avaliamos a transdução transitória lentiviral de um gene repórter GFP nas protoscolés e vermes estroboscópicos de E. granulosus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Compreender a base molecular de nematoides e platyhelminthes biologia é crucial para entender a patogenicidade dos parasitas zoonóticos27. A falta de um sistema de avaliação genética eficaz é um grande obstáculo para a interpretação direta da genética funcional dos parasitas cestode, incluindo a espécie Echinococcus 12,27. O presente estudo demonstra o excelente potencial do lentivírus na transdução transitória …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Elite Researcher Grant Committee sob o prêmio número 958680 do Instituto Nacional de Desenvolvimento de Pesquisa Médica (NIMAD), Teerã, Irã.
Materials
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
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