Echinococcus granulosus의 스트로빌화 된 형태의 일시적인 형질 도입
1Student Research Committee, School of Medicine,Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran,Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine,Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine,Jilin University
Summary
우리는 세 번째 세대 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 Echinococcus granulosus 의 다른 발달 단계에서 신속한 일시적인 형질 도입 기술을 설명합니다.
Abstract
낭포성 echinococcosis 또는 hydatid 질병은 송곳니의 장에 숨어있는 작은 촌충 인 Echinococcus granulosus 에 의해 야기 된 가장 중요한 동물 유행성 기생충 질병 중 하나입니다. 병인과 질병 조절 및 예방의 메커니즘을 이해하기 위해 유전자 연구를 적용해야 할 긴급한 필요성이 있다. 그러나 효과적인 유전자 평가 시스템의 부족은 Echinococcus 종을 포함한 cestode 기생충의 기능적 유전학에 대한 직접적인 해석을 방해합니다. 본 연구는 E. granulosus의 metacestode 및 strobilated 형태에서 렌티바이러스 유전자 일시적 형질도입의 가능성을 입증한다. 프로토스콜렉세스(PSCs)를 수성체 낭종으로부터 분리하고 특정 이족 배양 배지로 옮겨 스트로빌화된 웜으로 발전시켰다. 웜을 형질도입 과정 대조군으로서 HEK293T 세포와 함께 수확된 3세대 렌티바이러스로 형질감염시켰다. 24 h 및 48 h에 걸쳐 스트로빌화 된 웜에서 뚜렷한 형광이 검출되었으며, 이는 E. granulosus에서 일시적인 렌티 바이러스 형질도입을 나타냅니다. 이 연구는 촌충에서 렌티 바이러스 기반 일시적인 형질도입에 대한 첫 번째 시도를 제시하고 편평충 생물학에 대한 실험 연구에서 잠재적 인 영향을 미치는 유망한 결과를 보여줍니다.
Introduction
낭포성 echinococcosis (CE)는 Taeniidae 1,2 가족 내의 작은 촌충 인 Echinococcus granulosus에 의해 유발되는 가장 중요한 기생충 질병 중 하나입니다. E. granulosus에 대한 면역 진단 및 백신 개발에 대한 광범위한 연구가 수행되었습니다. 그러나 기생충 생물학의 분자 기초에 대한 부적절한 지식은 하이다티드 질병 3,4,5,6의 진단, 관리 및 예방에 큰 한계를 제기합니다.
최근 몇 년 동안, 게놈 시퀀싱 및 전사 방법의 개발로 인해, 여러 연구 그룹 7,8,9에 의해 편평충에 대한 광범위한 분자 연구가 수행되었습니다. 그러나 기생충의 세계에서, 기생 편평충의 유전자 전달 기술의 발전은 일부 원생동물10,11,12를 위해 개발 된 재현성이 높은 일시적인 형질도입 방법과 비교하여 여전히 제한적입니다.
바이러스 전달 시스템의 사용은 지난 20 년 동안 전이유전자 전달 및 유전자 / 단백질 조사를위한 필수 도구로 부상했습니다13. 렌티바이러스는 분열 세포와 비분열 세포를 모두 감염시켜 유사분열 후 세포 14,15,16을 감염시킬 수 있다. 최근의 증거는 포유동물 세포에서 렌티바이러스 기반 형질도입 시스템을 사용하는 것이 이전의 녹인/녹다운 기술의 한계 대부분을 극복할 수 있는 잠재력을 제공한다는 것을 나타낸다. GFP 발현과 같은 적절한 분자 마커를 갖는 발현 렌티바이러스 벡터의 설계 및 구축은 앞서16에서 설명되었다. 따라서, 우리는 E. granulosus의 protoscoleces 및 strobilated worms에서 GFP 리포터 유전자의 렌티바이러스 일시적 형질도입을 평가한다.
Protocol
이 연구는 국립 의학 연구 개발 연구소 및 연구 윤리 검토위원회, No. 958680의 승인을 받았다. 렌티바이러스는 BSL-2 유기체로 분류되고; 따라서, 이 프로토콜의 모든 실험실 배양 절차는 멸균 실험실 관행을 사용하여 수행되었고, NIH 가이드라인에 따라 층류 후드 하에서 수행되었다. 도 1은 상이한 E. 과립 단계에 대한 연구 프로토콜의 개략적인 프리젠테이션을 도시한다….
Representative Results
여기에서, 우리는 세 번째 세대 렌티바이러스 벡터를 사용하여 E. granulosus에서 신속하고 효율적인 일시적 형질도입 기술을 기술한다. PSCs를 이phasic 배지에서 배양하여 앞서 기술한 바와 같이 스트로빌화된 웜을 수득하였다(25,26). Protoscolece는 시험관 내에서 6 주 후에 스트로빌 화 된 웜으로 발전합니다. E. granulosus의 상이한 단계는 질?…
Discussion
선충류와 Platyhelminthes 생물학의 분자 기초를 이해하는 것은 동물 유행성 기생충의 병원성을 이해하는 데 중요합니다27. 효과적인 유전자 평가 시스템의 부족은 Echinococcus 종12,27을 포함한 cestode 기생충의 기능적 유전학의 직접적인 해석에 큰 장애물입니다. 본 연구는 E. granulosus transient transduction에서 lentivirus의 우수한 잠재?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 간행물에서보고 된 연구는 엘리트 연구원 보조금위원회가이란 테헤란의 국립 의학 연구 개발 연구소 (NIMAD)의 수상 번호 958680으로 지원되었습니다.
Materials
| 12-well culture plates | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 cm2 culture flask | SPL Life Sciences | 70325 | |
| 6-well culture plates | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Working concentration: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medium | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 incubator | memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Dog bile | Isolated from a euthanized dog and sterilized by 0.2 μm syringe filter | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | prepare 0.1% of Eosin for working exclusion test |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Heat inactivation of FBS (30 min in 40 °C) |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Heat inactivation of FCS (30 min in 40 °C) |
| HEK293T cells | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Human embryonic kidney 293T |
| HEPES buffered saline (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrate |
| Inverted fluorescence microscope | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032-10MU | Working concentration: 100 IU/mL |
| Pepsin | Roche | 10108057001 | Working concentration: 2 mg/mL, pH 2 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | This reagent solve in less than 1 min in D.W |
| Polybrene (Transfection reagent) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI medium | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Working concentration: 100 μg/mL |
| Third-generation lentiviral plasmid (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Transfer vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pLPI and pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Third-generation lentiviral plasmid (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | Helper vector (obtained commercially from Molecular Medicine Research Department of Iranian Academic Center for Education, Culture and Research (ACECR), Mashhad, Iran) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x working solutions (pH 7.4–7.6) |
Referências
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315 (2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020 (2021).
- Eckert, J., Thompson, R. C. A. Historical aspects of echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).
- Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213 (2017).
- Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. Echinococcosis: control and prevention. Advances in Parasitology. 95, 55 (2016).
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315 (2017).
- Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
- Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
- Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
- Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
- Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
- Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. Transfection of Platyhelminthes. BioMed Research International. 2015, 206161 (2015).
- Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
- Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. Establishing transgenic schistosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230 (2011).
- Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. Lentiviral transduction of microglial cells. Glia. 50 (1), 48-55 (2005).
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
- Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
- Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
- Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190 (2020).
- Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755 (2008).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031 (2012).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
- Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
- Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991 (2018).
- Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
- Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
- Thompson, R. C. A., Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. 95, 65-109 (2017).
- Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
- Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496 (2015).
Citar este artigo
Mohammadi, M. A., Afgar, A., Faridi, A., Mousavi, S. M., Derakhshani, A., Borhani, M., Fasihi Harandi, M. Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus. J. Vis. Exp. (187), e62783, doi:10.3791/62783 (2022).