Cryo-EM için Yüksek Sıcaklık Numune Izgaralarının Hazırlanması
Summary
Bu makale, kriyo-EM deneyleri için donma işlemine dalmadan önce, 70 ° C’ye kadar yüksek sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.
Abstract
Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) deneyleri için numune ızgaraları genellikle biyolojik numunelerin depolanması için en uygun sıcaklıkta, çoğunlukla 4 ° C’de ve bazen oda sıcaklığında hazırlanır. Son zamanlarda, düşük sıcaklıkta çözülen protein yapısının, özellikle termofilik arkelerden gelen proteinler için işlevsel olarak alakalı olmayabileceğini keşfettik. Kriyo-EM analizi için daha yüksek sıcaklıklarda (70 ° C’ye kadar) protein örnekleri hazırlamak için bir prosedür geliştirilmiştir. Daha yüksek sıcaklıklarda hazırlanan numunelerden elde edilen yapıların işlevsel olarak alakalı ve sıcaklığa bağlı olduğunu gösterdik. Burada, örnek olarak 55 °C kullanarak numune ızgaralarını yüksek sıcaklıkta hazırlamak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Deney, ek bir santrifüj tüpü kullanılarak modifiye edilmiş bir vitrifikasyon aparatı kullandı ve numuneler 55 ° C’de inkübe edildi. Ayrıntılı prosedürler, buhar yoğuşmasını en aza indirmek ve ızgarada ince bir buz tabakası elde etmek için ince ayarlandı. Başarılı ve başarısız deneylere örnekler verilmiştir.
Introduction
Protein komplekslerinin yapılarını çözmek için kriyo-EM teknolojisi, özellikle yüksek çözünürlüklü yapıların elde edilmesi yönünde gelişmeye devam etmiştir 1,2. Bu arada, vitrifikasyon prosesinden önce pH veya ligandlar gibi numune koşullarının değiştirilmesiyle uygulama alanı da genişletilmiştir3, bu da numune ızgaralarının hazırlanmasını ve ardından dalma dondurma 4,5’i içerir. Bir diğer önemli koşul sıcaklıktır. X-ışını kristalografisi gibi kriyo-EM deneyleri düşük sıcaklıklarda yapılmasına rağmen, kriyo-EM ile çözülen yapı, vitrifikasyondan önceki çözelti durumundaki yapıyı yansıtır. Yakın zamana kadar, tek parçacık analizi (SPA) kriyo-EM çalışmalarının çoğu, vitrifikasyon6’dan önce buz üzerinde (yani 4 ° C’de) tutulan örnekleri kullanır, ancak bir dizi çalışma oda sıcaklığında 7,8,9,10 veya 42 ° C 11 kadar yüksek numuneler kullanır. Yakın tarihli bir raporda, termofilik arkeon Sulfolobus solfataricus’tan (Sso) ketol-asit redüktoizomeraz (KARI) enziminin sıcaklığa bağlı çalışmalarını 4 ° C ila 70 ° C12 arasında altı farklı sıcaklıkta gerçekleştirdik. Çalışmalarımız, fonksiyonel olarak ilgili sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamanın önemli olduğunu ve kriyo-EM’nin aynı protein kompleksinin yapısını çoklu sıcaklıklarda çözmek için pratik olarak mümkün olan tek yapısal yöntem olduğunu göstermektedir.
Yüksek sıcaklıklarda vitrifikasyon için en büyük zorluk, buhar yoğuşmasını en aza indirmek ve ince buz elde etmektir. Burada, Sso-KARI 12 ile ilgili önceki çalışmamızda yüksek sıcaklıklarda numune ızgaraları hazırlamak için kullanılan ayrıntılı protokolü sunuyoruz. Okuyucuların veya izleyicilerin kriyo-EM deneyleri için genel numune hazırlama ve veri işleme prosedürlerinde zaten deneyimli olduklarını varsayıyoruz ve yüksek sıcaklıkla ilgili yönleri vurguluyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolün 1. adımında, santrifüj tüpünün iyi monte edildiğinden ve deney devam ederken düşmediğinden emin olun. Haznede, filtre kağıdının adsorpsiyon kapasitesini değiştirebilecek çok sayıda su damlacığının birikmesi nedeniyle, vitrifikasyon aparatı haznesi denge sıcaklığına ulaştıktan sonra deneyin toplam süresinin 30 dakikayı geçmemesi önerilir. Çalışma süresi 30 dakikayı aşarsa, operatörün filtre kağıdını değiştirmesi ve kabinin sıcaklık ve nemi tekrar dengelemesini b…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, yararlı tavsiyeler için Thermo Fisher Scientific’ten Dr. Hervé Remigy’ye teşekkür eder. Kriyo-EM deneyleri Academia Sinica Cryo-EM Tesisi’nde (ASCEM) gerçekleştirildi. ASCEM, Academia Sinica (Hibe No. AS-CFII-108-110) ve Tayvan Protein Projesi (Hibe No. AS-KPQ-109-TPP2). Yazarlar ayrıca numune hazırlama konusundaki yardımları için Bayan Hui-Ju Huang’a teşekkür eder.
Materials
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
Referências
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do’s and don’ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
