Подготовка высокотемпературных сеток для отбора проб для крио-ЭМ
Summary
В этой статье представлен подробный протокол подготовки сеток для образцов при температурах до 70 °C перед погружением замораживания для крио-ЭМ-экспериментов.
Abstract
Сетки образцов для экспериментов криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) обычно готовят при температуре, оптимальной для хранения биологических образцов, в основном при 4 °C и иногда при комнатной температуре. Недавно мы обнаружили, что структура белка, решенная при низкой температуре, может быть функционально неактуальной, особенно для белков из термофильных архей. Была разработана процедура подготовки образцов белка при более высоких температурах (до 70 °C) для крио-ЭМ-анализа. Мы показали, что структуры из образцов, полученных при более высоких температурах, функционально значимы и зависят от температуры. Здесь мы опишем подробный протокол подготовки пробных сеток при высокой температуре, используя в качестве примера 55 °C. В эксперименте использовали витрификационный аппарат, модифицированный с использованием дополнительной центрифужной трубки, и образцы инкубировали при 55 °C. Подробные процедуры были точно настроены, чтобы свести к минимуму конденсацию пара и получить тонкий слой льда на сетке. Приведены примеры успешных и неудачных экспериментов.
Introduction
Крио-ЭМ-технология решения структур белковых комплексов продолжала совершенствоваться, особенно в направлении получения структур высокого разрешения 1,2. В то же время ландшафт его применения также был расширен за счет изменения условий отбора проб, таких как рН или лиганды, до процесса витрификации3, который включает в себя подготовку сеток образцов с последующим погружным замораживанием 4,5. Еще одним важным условием является температура. Хотя крио-ЭМ-эксперименты, такие как рентгеновская кристаллография, выполняются при низких температурах, структура, решаемая крио-ЭМ, отражает структуру в состоянии раствора до витрификации. До недавнего времени в большинстве крио-ЭМ-исследований анализа одиночных частиц (SPA) использовались образцы, которые хранятся на льду (т.е. при 4 °C) до витрификации6, хотя в ряде исследований используются образцы при комнатной температуре около 7,8,9,10 или до 42 °C 11. В недавнем отчете мы провели температурно-зависимые исследования фермента кетол-кислотной редуктоизомеразы (KARI) из термофильного археона Sulfolobus solfataricus (Sso) при шести различных температурах от 4 ° C до 70 ° C12. Наши исследования показывают, что важно готовить сетки образцов при функционально значимых температурах и что крио-ЭМ является единственным структурным методом, который практически осуществим для решения структуры одного и того же белкового комплекса при нескольких температурах.
Основная трудность для витрификации при высоких температурах заключается в минимизации конденсации пара и достижении тонкого льда. Здесь мы сообщаем о подробном протоколе, используемом для подготовки сеток образцов при высоких температурах в нашем предыдущем исследовании Sso-KARI 12. Мы предполагаем, что читатели или зрители уже имеют опыт в общих процедурах подготовки образцов и обработки данных для крио-ЭМ-экспериментов, и подчеркиваем аспекты, относящиеся к высокой температуре.
Protocol
Representative Results
Discussion
На шаге 1 протокола убедитесь, что трубка центрифуги установлена хорошо и не падает во время эксперимента. В связи с накоплением в камере большого количества капель воды, которые могли изменить адсорбционную способность фильтровальной бумаги, рекомендуется, чтобы общее время эксперим?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят доктора Эрве Ремиджи из Thermo Fisher Scientific за полезные советы. Крио-ЭМ-эксперименты проводились в Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM поддерживается Academia Sinica (Грант No. AS-CFII-108-110) и Тайваньский протеиновый проект (грант No. AS-KPQ-109-TPP2). Авторы также благодарят г-жу Хуэй-Цзюй Хуан за помощь в подготовке проб.
Materials
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
Referências
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do’s and don’ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
