Geautomatiseerde, high-throughput detectie van bacteriële hechting aan gastheercellen
Summary
Detectie van gastheer-bacteriële pathogene interacties op basis van fenotypische therapietrouw met behulp van high-throughput fluorescentie labeling beeldvorming samen met geautomatiseerde statistische analysemethoden maakt een snelle evaluatie van potentiële bacteriële interacties met gastheercellen mogelijk.
Abstract
Identificatie van opkomende bacteriële pathogenen is van cruciaal belang voor de menselijke gezondheid en veiligheid. Bacteriële hechting aan gastheercellen is een essentiële stap in bacteriële infecties en vormt een kenmerk van potentiële bedreiging. Daarom kan het onderzoeken van de hechting van bacteriën aan gastheercellen worden gebruikt als onderdeel van bacteriële dreigingsanalyse. Een standaardmethode voor het opsommen van bacteriële hechting aan gastheercellen is om bacteriën samen met gastheercellen te incuberen, de aanhangende bacteriën te oogsten, de geoogste cellen op vaste media te plaatsen en vervolgens de resulterende kolonievormende eenheden (CFU) te tellen. Als alternatief kan bacteriële hechting aan gastheercellen worden geëvalueerd met behulp van immunofluorescentiemicroscopie-gebaseerde benaderingen. Conventionele strategieën voor het implementeren van deze benaderingen zijn echter tijdrovend en inefficiënt. Hier wordt een recent ontwikkelde geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie-gebaseerde beeldvormingsmethode beschreven. In combinatie met high-throughput beeldverwerking en statistische analyse maakt de methode een snelle kwantificering mogelijk van bacteriën die zich hechten aan gastheercellen. Twee bacteriesoorten, Gram-negatieve Pseudomonas aeruginosa en Gram-positieve Listeria monocytogenes en bijbehorende negatieve controles, werden getest om het protocol aan te tonen. De resultaten tonen aan dat deze aanpak snel en nauwkeurig aanhankelijke bacteriën opsomt en experimentele werklast en tijdlijnen aanzienlijk vermindert.
Introduction
Bacteriële hechting is een proces waarbij bacteriën zich hechten aan andere cellen of oppervlakken. Succesvolle vestiging van infectie door bacteriële pathogenen vereist adhesie aan gastheercellen, kolonisatie van weefsels en in sommige gevallen invasie van gastheercellen1,2,3. Opkomende infectieziekten vormen grote bedreigingen voor de volksgezondheid, zoals blijkt uit de recente COVID-19-pandemie4,5,6. Belangrijk is dat nieuwe of opkomende pathogenen mogelijk niet gemakkelijk worden onderscheiden met behulp van genomische benaderingen, vooral in gevallen waarin de ziekteverwekker is ontworpen om detectie te ontwijken of geen genomische handtekeningen bevat die het als pathogeen identificeren. Daarom kan de identificatie van potentiële pathogenen met behulp van methoden die kenmerken van pathogeniciteit direct beoordelen, zoals bacteriële hechting aan gastheercellen, een cruciale rol spelen bij de identificatie van pathogenen.
Bacteriële hechting aan gastheercellen wordt al tientallen jaren gebruikt om mechanismen van bacteriële pathogenese te evalueren1,7. Microscopische beeldvorming8,9 en de opsomming van bacteriële kolonievormende eenheid (CFU)10,11,12,13 door post-infectie plating zijn twee goed ontwikkelde laboratoriummethoden voor het testen van microbiële hechting en / of infectie van gastheercellen14. Gezien de micrometerschaalgrootte van bacteriële cellen, vereist de inventarisatie van de aanhangende bacteriële cellen over het algemeen het gebruik van geavanceerde microscopietechnieken met hoge vergroting, evenals beeldvormingsbenaderingen met hoge resolutie, waaronder elektronenmicroscopie, expansiemicroscopie (ExM)15,16en driedimensionale beeldvorming17 . Als alternatief kan de opsomming van bacteriën die gebonden zijn aan of geïnternaliseerd zijn in gastheercellen worden uitgevoerd door de verdunningsreeks van geoogste bacteriën op vaste agar te platen en de resulterende CFU’s10,12,13te tellen . Deze methode is bewerkelijk en omvat veel handmatige stappen, wat problemen oplevert bij het vaststellen van een gestandaardiseerde of geautomatiseerde procedure die vereist is voor analyses met een hoge doorvoer18,19. Daarom zou de ontwikkeling van nieuwe methoden voor het evalueren van gastheercelaanhechting de huidige beperkingen in het veld aanpakken.
Een dergelijke methode wordt hier beschreven die gebruik maakt van geautomatiseerde high throughput microscopie, gecombineerd met high throughput beeldverwerking en statistische analyse. Om de aanpak aan te tonen, werden experimenten met verschillende bacteriële pathogenen uitgevoerd, waaronder Pseudomonas aeruginosa, een opportunistische Gram-negatieve bacteriële ziekteverwekker van mensen, dieren en planten14,20, waarvan vaak wordt vastgesteld dat het de luchtwegen koloniseert van patiënten met verminderde afweerfuncties van de gastheer. Deze aanpak optimaliseerde het microscopische beeldvormingsproces beschreven in eerdere studies14,20. De beeldvormingsdetectie werd vereenvoudigd door fluorescentie-gelabelde gastheercellen en bacteriën om de nabijheid ervan snel te volgen, wat de microscopiebelasting drastisch verminderde om beelden met een hoge resolutie te krijgen voor het onderscheiden van bacteriën. Bovendien verving de geautomatiseerde statistische analyse van beelden bij het tellen van gastheercellen en bacteriën het hands-on experiment van bacteriële CFU-plating om de verhouding van het aantal adherente bacteriën per gastheercel te schatten. Om de compatibiliteit van deze methode te bevestigen, zijn ook meerdere bacteriestammen en gastheerceltypen getest, zoals Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus pt Klebsiella pneumoniae, evenals menselijke navelstrengas endotheelcellen (HUVECs), en de resultaten ondersteunen de diversiteit en effectiviteit van de methode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol beschrijft een geautomatiseerde aanpak voor het opsommen van bacteriële hechting aan gastheercellen. De beschreven aanpak heeft verschillende aantrekkelijke voordelen ten opzichte van conventionele methoden. Ten eerste maakt deze aanpak de nauwkeurige kwantificering mogelijk van het aantal microbiële pathogene cellen dat aan individuele gastheercellen is bevestigd. Belangrijk is dat deze kwantificering kan worden uitgevoerd zonder de noodzaak van moeizaam bacterieoogst, seriële verdunningen, plating op va…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn Dr. Kaite Zlotkowski van Biotek Inc. dankbaar voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Defensie onder contractnummer W911NF1920013 aan PdF, het Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) en het ministerie van Binnenlandse Zaken onder contract nr. 140D6319C0029 aan PdF. De inhoud van de informatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs het standpunt of het beleid van de regering en er mag geen officiële goedkeuring worden afgeleid.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
Referências
- Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
- Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
- Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
- Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
- Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
- Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
- Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
- Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
- Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
- Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
- Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
- Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
- Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
- Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
- Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
- Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
- Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
- Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
- Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
- Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
- Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
- Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).
