Summary
Этот протокол представляет собой метод исследования белково-белковых взаимодействий с использованием глутатион-связанных донорских шариков с GST-сплавленными TPR-мотив-ко-шаперонами и акцепторными шариками в сочетании с пептидом, полученным из Hsp90. Мы использовали этот метод для скрининга небольших молекул для нарушения взаимодействий Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52 и идентифицировали мощные и селективные ингибиторы взаимодействия Hsp90-FKBP51.
Abstract
Нацеливание на взаимодействие белка теплового шока 90 (Hsp90)-кочаперона дает возможность специфически регулировать Hsp90-зависимые внутриклеточные процессы. Законсервированный пентапептид MEEVD на С-конце Hsp90 отвечает за взаимодействие с мотивом тетратрикопептидного повтора (TPR) ко-шаперонов. FK506-связывающий белок (FKBP) 51 и FKBP52 являются двумя аналогичными TPR-мотивными ко-шаперонами, участвующими в стероидных гормонозависимых заболеваниях с различными функциями. Таким образом, идентификация молекул, специфически блокирующих взаимодействия между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52, обеспечивает многообещающий терапевтический потенциал для нескольких заболеваний человека. Здесь мы описываем протокол для усиленного люминесцентного равноконтактного однородного анализа для зондирования взаимодействий между Hsp90 и его партнерскими ко-шаперонами FKBP51 и FKBP52. Во-первых, мы очистили TPR-мотив-содержащие белки FKBP51 и FKBP52 в форме, помеченной глутатион S-трансферазой (GST). Используя глутатион-связанные донорские шарики с GST-сплавленными белками TPR-мотива и акцепторными шариками в сочетании с 10-мерным С-концевым пептидом Hsp90, мы исследовали белково-белковые взаимодействия в однородной среде. Мы использовали этот анализ для скрининга небольших молекул для нарушения взаимодействий Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52 и идентифицировали мощные и селективные ингибиторы взаимодействия Hsp90-FKBP51.
Introduction
Молекулярные шапероны способствуют гомеостазу белка, включая сворачивание белка, транспорт и деградацию. Они регулируют несколько клеточных процессов и связаны с многочисленными заболеваниями, такими как рак и нейродегенеративные заболевания1. Белок теплового шока 90 (Hsp90) является одним из наиболее важных шаперонов, функция которого зависит от конформационных изменений, вызванных гидролизом АТФ и связыванием с клиентскими белками, опосредованными его ко-шаперонами2. Несмотря на очевидный потенциал Hsp90 в качестве терапевтической мишени, тонкая настройка его функции представляет собой большую проблему. Существует несколько ингибиторов Hsp90, нацеленных на N-концевую область связывания АТФ, которые были оценены в клинических испытаниях, но ни один из них не был одобрен для маркетинга3. Из-за отсутствия четко определенного лигандсвязывающегокармана 4,нацеливание на С-концевую область Hsp90 имело ограниченный успех4. В последнее время нарушение взаимодействий Hsp90-кохаперонов малыми молекулами было исследовано в качестве альтернативной стратегии5. Нацеливание на взаимодействия Hsp90-кохаперонов не вызывает общей реакции клеточного стресса и дает возможность специфически регулировать различные внутриклеточные процессы. Законсервированный пентапептид MEEVD на С-конце Hsp90 отвечает за взаимодействие с мотивом тетратрикопептидного повтора (TPR) ко-шаперонов6. Из 736 белков, содержащих мотивы TPR, аннотированных в базе данных белков человека, ~ 20 различных белков взаимодействуют с Hsp90 через этотпептид 7. Молекулы, конкурирующие за пептидное связывание MEEVD, нарушат взаимодействие между Hsp90 и ко-шаперонами, содержащими домен TPR. Сайт связывания пептидов имеет сходную третичную структуру, но общая гомология между различными доменами мотивов TPR относительно низкая7,что дает возможность идентифицировать молекулы, специально способные блокировать взаимодействия между Hsp90 и конкретными TPR-мотивными ко-шаперонами. Среди этих TPR-мотивных ко-шаперонов FK506-связывающий белок (FKBP) 51 и FKBP52 являются регуляторами передачи сигналов рецепторов стероидных гормонов (SHR) и участвуют в нескольких стероидных гормонозависимых заболеваниях, включая рак, связанные со стрессом заболевания, метаболические заболевания и болезнь Альцгеймера8. Хотя FKBP51 и FKBP52 имеют > 80% сходства последовательностей, их функции различаются: FKBP52 является положительным регулятором деятельности SHR, в то время как FKBP51 является отрицательным регулятором в большинстве случаев8. Таким образом, идентификация молекул, специфически блокирующих взаимодействия между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52, обеспечивает многообещающий терапевтический потенциал для связанных заболеваний.
Усыпляемый L-умингесцентный Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) был впервые разработан в 1994 году Ullman EF et al.9. В настоящее время он широко используется для обнаружения различных типов биологических взаимодействий, таких какпептид 10,белок11,ДНК12,РНК13и сахар14. В этой технике существует два вида бусин (диаметр 200 нм), один из них является донорской бусиной, а другой - акцепторной бусиной. Биомолекулы иммобилизуются на эти шарики; их биологические взаимодействия приводят к сближению бусин донора и акцептора. При 680 нм фотосенсибилизатор в донорской бусине освещает и преобразует кислород в синглетный кислород. Поскольку синглетный кислород имеет короткое время жизни, он может диффундировать только до 200 нм. Если шарик акцептора находится в непосредственной близости, его производное тиоксена реагирует с синглетным кислородом, генерируя хемилюминесценцию при 370 нм. Эта энергия дополнительно активирует флуорофоры в том же акцепторном шарике, чтобы излучать свет при 520-620 нм15. Если биологические взаимодействия нарушаются, акцепторная бусина и донорская бусина не могут достичь близости, что приводит к распаду синглетного кислорода и низкому образуемого сигнала.
Здесь мы описываем протокол, использующий этот метод для скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия между Hsp90 и TPR ко-шаперонами, особенно FKBP51 и FKBP52. 10 аминокислот длинных пептидов, соответствующих экстремальному С-конце Hsp90, прикреплены к акцепторным шарикам. Очищенные GST-помеченные ко-шапероны TPR взаимодействуют с донорскими шариками, связанными с глутатионом. Когда взаимодействие между пептидами, полученными из Hsp90, и ко-шаперонами TPR-мотива сближает шарики, образуется усиленный сигнал(рисунок 1A). Если экранированные малые молекулы могут ингибировать взаимодействия между Hsp90 и TPR-мотивными ко-шаперонами, этот усиленный сигнал будет уменьшен(рисунок 1B). Их IC50 может быть рассчитан путем количественного измерения. Этот протокол может быть распространен на любые интересующих взаимодействия шаперона - TPR-мотива и имеет большое значение в разработке новых молекул, в частности блокирующих взаимодействие между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52.
Рисунок 1:Основной принцип этого анализа. (A) Очищенный GST-FKBP51 взаимодействует с глутатион-связанными донорскими шариками. 10 аминокислот длинных пептидов, соответствующих экстремальному С-конце Hsp90, прикреплены к акцепторным шарикам. Взаимодействие между пептидами, полученными из Hsp90, и доменом TPR FKBP51 приближает донорские и акцепторные шарики. При 680 нм фотосенсибилизатор в донорской бусине освещает и преобразует кислород в синглетный кислород. Производное тиоксена на акцепторной бусине реагирует с синглетным кислородом и генерирует хемилюминесценцию при 370 нм. Эта энергия дополнительно активирует флуорофоры в том же акцепторном шарике, чтобы излучать свет при 520-620 нм. (B) Когда малые молекулы ингибируют взаимодействия между Hsp90 и FKBP51, донорские и акцепторные шарики не могут достичь близости. Затем синглетный кислород с коротким сроком службы распадается, и не вырабатывается обнаруживаемый сигнал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор этого протокола показан на рисунке 2.
1. Экспрессия и очистка GST-FKBP51 и GST-FKBP52(рисунок 2A)
-
Плазмиды
ПРИМЕЧАНИЕ: Получите клоны кДНК для человека FKBP51 (идентификатор клона: 5723416) и для человека FKBP52 (идентификатор клона: 7474554) от консорциума IMAGE.- Амплифицировать ДНК человека FKBP51 с помощью ПЦР праймерами (вперед; 5'GGATCCATGACTGATGATGAAGGT-3', реверс; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3'), содержащими навесы BamHI и XhoI и клонировать в вектор pGEX6-1 на сайтах ограничения BamHI / XhoI.
- Амплифицировать ДНК человека FKBP52 с помощью ПЦР праймерами (вперед; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', обратно; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3'), содержащими навесы EcoRI и XhoI, и клонировать в вектор pGEX6-2 в местах ограничения EcoRI / XhoI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка и условия реакции ПЦР приведены в таблице 1 и таблице 2. - Проверьте вставленную последовательность и преобразуйте плазмиды в химически компетентную Кишечной палочкой в соответствии с протоколом изготовления.
-
Экспрессия и очистка белка
- Добавьте 25 г основы бульона Лурия (LB) в 1 л дистиллированной воды, чтобы получить раствор LB. Автоклав при 121 °C в течение 15 мин. После охлаждения добавьте 50 мкг/мл ампициллина.
- Возьмите колонию бактерий, экспрессивляющих GST-FKBP51 или GST-FKBP52, и смешайте с 500 мкл раствора LB в пробирке 1,5 мл. Вихрь.
- Добавьте смесь "1.2.2" в 1 л раствора LB в колбу Эрленмайера, покрытую алюминиевой фольгой. Высиживание колбы Эрленмейера в шейкере на ночь при 37 °C.
- Индуцируют экспрессию белка путем добавления 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактозида (IPTG) в колбу Эрленмейера и продолжают инкубацию еще 2 ч.
- Чтобы получить гранулы клеток, центрифугируют при 5000 х г в течение 15 мин. Удалите супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы ячейки могут храниться при -20 °C. - Повторно суспендировать гранулы клеток в 40 мл PBS и процедить 3 х 20 с на льду. Добавьте 1 мМ PMSF, 1 мМ ЭДТА и коктейль ингибитора протеазы (1 таблетка) для предотвращения протеолиза.
- Центрифугируют суспензию в течение 30 мин 50 000 х г для удаления остатков клеток и нанесите супернатант на колонку GST-ловушки 5 мл.
- После промывки колонны 30 мл ПБС, элюют GST-FKBP51 и GST-FKBP52 5 мл 10 мМ глутатиона в ПБС.
- Концентрат белков на центрифугированной установке 15 мл 10.000 MWCO. Чтобы удалить свободный глутатион, пропустите концентраты через колонну PD-10, уравновешиваемую 0,5x PBS, и снова сконцентрируйте на фильтрующем центрифуге.
- Собирайте белковые фракции. Проверьте белки в SDS-PAGE и отрегулируйте концентрацию белка до 1 мг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный выход белка составляет 2-5 мг/л культуры. Белок может храниться при -20 °C.
2. Соединение С-концевого пептида Hsp90 с бусинами акцептора(рисунок 2B)
-
Пептидный препарат Hsp90
- Синтез десяти аминокислот пептида NH 2-EDASRMEEVD-COOH, соответствующего аминокислотам 714-724 человеческой бета-изоформы Hsp90 (UniProt ID: P08238) с помощью службы синтеза пептидов.
- Развести пептид Hsp90 в PBS до концентрации 1 мг/мл.
-
Приготовление акцепторных бусин
- Разбавляют неконъюгированные акцепторные шарики в PBS до концентрации 1 мг/мл и переносят в пробирку 1,5 мл.
- Выполните промывку центрифугированием при 16 000 х г в течение 15 мин. Осторожно удалите супернатант.
-
Спряжение
- Установите соотношение между шариками и пептидом как 10:1. В пробирку 1,5 мл, содержащую 1 мг гранул акцепторного шарика (приготовленных так, как описано выше), добавляют 1 мл PBS (рН 7,4), 0,1 мг разбавленного пептида, 1,25 мкл Tween-20, 10 мкл раствора цианоборогидрида натрия 400 мМ (NaBH3CN).
ВНИМАНИЕ: NaBH3CN токсичен; использовать вытяжной капюшон и перчатки. Раствор NaBH3CN должен быть свежеприготовлен. - Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C с сквозным перемешиванием (10-20 об/мин) на ротационном шейкере.
- Установите соотношение между шариками и пептидом как 10:1. В пробирку 1,5 мл, содержащую 1 мг гранул акцепторного шарика (приготовленных так, как описано выше), добавляют 1 мл PBS (рН 7,4), 0,1 мг разбавленного пептида, 1,25 мкл Tween-20, 10 мкл раствора цианоборогидрида натрия 400 мМ (NaBH3CN).
-
Реакционная закалка и промывка бусин
- Добавляют 20 мкл 1 М Трис-HCl (рН 8,0) раствора в реакцию с целью блокирования непрореагиированных участков. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C.
- Центрифуга при 16 000 x g (или максимальной скорости) в течение 15 мин при 4 °C. Удалите супернатант и повторно суспендируем гранулу шарика в 1 мл раствора Tris-HCl (100 мМ, рН 8,0).
- Повторите шаг стирки три раза.
- После последней центрифугирования повторно суспендировать шарики по 1 мг/мл в буфере хранения (1 мл 0,5 × PBS с 0,01% азида натрия в качестве консерванта). Храните сопряженный раствор акцепторного шарика при 4 °C, защищенном от света.
ВНИМАНИЕ: Азид натрия токсичен; использовать вытяжной капюшон и перчатки.
3. Анализ, прощупывающий взаимодействие между GST-FKBP51 или GST-FKBP52 и Hsp90 C-концевым пептидом и ингибирование соединениями малой молекулярной массы(рисунок 2C)
-
Белки, помеченные GST, взаимодействующие с бусинами донора глутатиона
- Настройте реакции в 384-скважинных пластинах.
- Готовят раствор, содержащий 10 мкг/мл шариков донора глутатиона в 0,5x PBS, рН 7,4.
ПРИМЕЧАНИЕ: После длительного хранения бусины оседают и должны быть вихревыми. - Добавьте GST-FKBP51 или GST-FKBP52 к конечной концентрации 10 мкг/мл.
- Инкубировать в темноте при 25 °C в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе белки, помеченные GST, будут взаимодействовать с глутатионом, прикрепленным к бусинам. Для каждой скважины будет использовано 22,5 мкл этой смеси. Концентрация связывающих партнеров должна определяться эмпирически. Титруйте GST-FKBP51 и GST-FKBP52 и выберите концентрацию, которая дает наилучший сигнал.
-
Добавление соединений
- Производят серийные разведения исследуемых соединений в ДМСО.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые концентрации обычно составляют 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 мкМ. - Добавьте 0,25 мкл DMSO (отрицательный контроль) или Hsp90 C-концевой пептид (положительный контроль, 30 мкМ) или соединений в DMSO в угол каждой скважины пластины. Используйте трипликаты для каждой концентрации соединения.
- Добавьте в каждую скважину 22,5 мкл раствора, содержащего донорские шарики глутатиона с белками, помеченными GST.
- Аккуратно встряхните тарелку рукой, но тщательно. Инкубировать в темноте при 25 °C в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени соединения будут взаимодействовать с доменом TPR на сайте связывания С-концевого пептида Hsp90.
- Производят серийные разведения исследуемых соединений в ДМСО.
-
Добавление бусин акцептора
- Разбавить бусины акцептора с присоединенным С-концевым пептидом Hsp90 до 100 мкг/мл в 0,5x PBS.
- Добавьте 2,25 мкл разбавленных акцепторных шариков в каждую скважину.
- Перемешать аккуратно, но тщательно. Инкубировать в темноте при 25 °C в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе донорские и акцепторные шарики сблизиваются в результате белково-пептидных взаимодействий. Конечный объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Поэтому конечные концентрации соединений находятся в диапазоне от 0,1 до 30 мкМ.
-
Чтение пластин
ПРИМЕЧАНИЕ: Считывание пластины с помощью считывателя пластин, установленного в соответствующем режиме.- Включите прибор и откройте программное обеспечение
- Выберите соответствующий протокол.
- Нажмите Редактировать карту пластины и выберите колодец, используемый в пластине для измерения.
- Нажмите кнопку Далее, чтобы продолжить и запустить выбранный протокол.
- После измерения нажмите кнопку Показать результаты, чтобы просмотреть результаты.
- Экспортируйте данные.
4. Анализ данных
-
Z' коэффициент и отношение сигнал/фон (S/B)
- Рассчитайте Z' множим и отношение S/B для анализа, используя следующее уравнение:
Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│16
S/B=μneg/μpos
где σ и μ представляют собой стандартные отклонения и средние значения положительного (Hsp90 C-концевой пептид, 30 мкМ) и отрицательного (DMSO) контрольных элементов соответственно. Коэффициент Z' > 0,5 гарантирует, что анализ достаточно надежен для скрининга. Для контроля чувствительности анализа также было рассчитано соотношение S/B.
- Рассчитайте Z' множим и отношение S/B для анализа, используя следующее уравнение:
-
Кривая "доза-реакция" и IC 50
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте нелинейный регрессионный анализ для соответствия данным ингибиторов Hsp90-кохаперонов PPI программным обеспечением.- Создайте таблицу данных XY в диалоговом окне приветствия и выберите X Numbers, а Y Enter 3 (если трипликаты) реплицирует значения в параллельных столбцах.
- Нормализовать сигнальные данные образцов к отрицательной контрольной группе. Импортируйте значения концентрации в столбец X и значения сигнала в столбец Y.
- Нажмите «Анализировать» и выберите «Преобразовать концентрацию (X)» в разделе «Преобразовать | Нормализовать. Выберите Преобразовать в логарифмы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это преобразует концентрацию в логарифмической шкале. Если начальная концентрация равна нулю, установите для нее очень маленькое число, которое фактически равно нулю (например, 0,1 нМ), чтобы не потерять эти значения, поскольку логарифм нуля не определен. - Нажмите «Анализировать» и выберите «Нелинейная регрессия (соответствие кривой)» в разделе Анализ XY,откройте «Доза-Реакция-Ингибирование» и выберите «Log(ингибитор) vs. response - Переменный наклон».
- Нажмите кнопку ОК, чтобы просмотреть Результаты (содержащие значение IC50) и Графики.
Рисунок 2:Схема этого протокола. (A) Экспрессия и очистка GST-FKBP51 и GST-FKBP52. (B) Соединение С-концевого пептида Hsp90 с бусинами акцептора. (C) Анализ, прощупствующий взаимодействие между GST-FKBP51 или GST-FKBP52 и Hsp90 C-концевым пептидом. Ингибирование соединениями малых молекулярных масс. Создано с помощью BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В нашем анализе Z'-фактор и отношение S/B составляют 0,82 и 13,35 соответственно(рисунок 3A),демонстрируя, что наш анализ является надежным и надежным для высокопроизводительного скрининга. Затем мы использовали его для скрининга соединений с малой молекулярной массой. На рисунке 3B представлено дозозависимое ингибирование взаимодействий шаперон-кохаперон с выбранной малой молекулой (D10). Кривые доза-реакция для D10 генерируются методом нелинейного регрессионного анализа, на основе которого рассчитываются значения IC50. D10 показывает дозозависимое ингибирование как на ИПП Hsp90 - GST-FKBP51, так и на Hsp90 - GST-FKBP52. Но значения IC50 различны: его IC50 для взаимодействий Hsp90 - GST-FKBP51 составляет 65 нМ, тогда как для взаимодействий Hsp90 - GST-FKBP52 полное ингибирование не было достигнуто при самой высокой концентрации соединения (100 мкМ), его IC50 оценивается > 30 мкМ. Эти результаты свидетельствуют о том, что селективное ингибирование ИПП Hsp90-HKBP51 или Hsp90-FKBP52 с малыми молекулами может быть достигнуто (домены TPR FKBP51 и FKBP52 имеют 60% идентичности последовательности и > 80% сходства последовательностей), и этот анализ может быть применен для этого скрининга.
Рисунок 3:Анализ и результаты анализа. (A) Z' коэффициент и отношение сигнала к фону (S / B) этого анализа. Данные представляют собой сигналы (○) положительного контроля (Hsp90 C-концевой пептид, 30 мкМ) и (●) отрицательного контроля (DMSO) из 48 скважин. Значение Z' 0,82 и отношение S/B 13,35 были рассчитаны на основе этих двух популяций данных. (B)Ингибирование выбранного соединения (D10) на взаимодействия hsp90 с FKBP51 (●) или FKBP52 (○) в этом анализе. D10 ингибирует Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52 в зависимости от дозы. Его IC50 составляет 65 нМ для взаимодействия Hsp90-FKBP51, но выше 30 мкМ для взаимодействия Hsp90-FKBP52. Данные нормализуются для контрольной группы и выражаются как средства ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Реакционный компонент | Объем (мкл) |
| Буфер ПЦР (5 х концентрат) | 4 |
| Грунтовка вперед | 1 |
| Обратная грунтовка | 1 |
| Плазмидные | 0.5 |
| смесь dNTP (10 мМ каждая) | 0.5 |
| Фузионная ДНК-полимераза | 0.5 |
| Вода (класс ДНК) | 12.5 |
| Итог | 20 |
Таблица 1: Реакция ПЦР, настроенная на амплификацию ДНК человека FKBP51 и FKBP52.
| Сцена | Температура (°C) | Время | Циклов |
| Начальная денатурация | 94 | 3 мин | 1 |
| Денатурация | 94 | 30 сек | 35 |
| Отжиг | 56 | 30 сек | |
| Расширение | 72 | 1 мин | |
| Окончательное продление | 72 | 5 мин | 1 |
| Примечание: Температура крышки составляет 105 °C. |
Таблица 2: Термоцилиндровые условия для амплификации ДНК человека FKBP51 и FKBP52.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем протокол, использующий анализ для скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия между Hsp90 и TPR-мотивными ко-шаперонами, особенно FKBP51 и FKBP52. Его высокий балл Z' (>0,8) демонстрирует надежность и надежность для формата с высокой пропускной способностью. Результаты могут быть получены в течение одного часа, и требуется небольшое количество шариков, белка и соединений. Более того, этот протокол может быть легко распространен на любые интересуемые взаимодействия Hsp90/Hsp70 - TPR-мотива. Несколько TPR-мотивных ко-шаперонов Hsp90 были замешаны в различных расстройствах человека, начиная от болезни Альцгеймера до аутоиммунных заболеваний, рака и т. Д. Протокол, описанный здесь, обеспечивает надежный и недорогой анализ in vitro для высокопроизводительного скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия шаперон-кочаперон, имеющие большое медицинское значение.
Кроме того, препараты, нацеленные на домены TPR и ингибирующие взаимодействие с Hsp90, должны оцениваться не только по их сродству к мишени, но и по их селективности по отношению к другим белкам TPR-мотива. Геном человека кодирует > 20 мотивных белков TPR, способных взаимодействовать с С-концевым пептидом Hsp90. Этот анализ с использованием шариков глутатиона и белков, помеченных GST, позволяет оценить влияние препарата на нескольких связывающих партнеров TPR. Наша лаборатория обладает библиотекой из 20 человеческих белков TPR в их GST-помеченной форме и может получить профили сродства и селективности для каждой тестируемой малой молекулы.
Ранее было показано, что PPI между Hsp90 и TPR ко-шаперонами опосредован С-концевым пептидом Hsp90; удаление Hsp90 C-terminus полностью отменяет связывание TPR-мотивных ко-шаперонов6. Мы обнаружили, что соединения, эффективные в нашем анализе, где использовался С-концевой пептид Hsp90, также смогли ингибировать взаимодействие полноразмерного Hsp90 с GST-FKBP51/52 в вытягивающем анализе с использованием бусин глутатиона сефарозы (данные не показаны). Некоторые из выбранных соединений также показывают сродство связывания с FKBP51 с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса, и их специфические сайты связывания, определяемые кокристаллизацией, в настоящее время исследуются.
Критическим шагом в нашем протоколе является порядок добавления; сначала мы формируем комплекс между небольшой молекулой и ее мишенью TPR. Если комплексы между FKBP51 и Hsp90 C-концевым пептидом уже сформированы, для разрыва ИПП требуется более длительное время инкубации и более высокие концентрации лекарственных соединений. Это в основном связано со стерическим препятствием бусины, ограничивающей доступ молекул к месту взаимодействия.
Можно ковалентно соединять белки TPR и С-концевые пептиды Hsp90 с донорскими и акцепторными шариками соответственно и непосредственно зондировать ИПП. Однако не рекомендуется ковалентно прикреплять обоих партнеров связывания к шарикам из-за уменьшенного движения молекул в растворе, влияющего на кинетику взаимодействий. Это также увеличивает риск стерического препятствия из-за размера бусины. Поэтому мы выбираем акцепторные бусины в сочетании с С-концевым пептидом Hsp90 и донорскими бусинами глутатиона, которые взаимодействуют с белками, помеченными GST, в нашем анализе, где могут быть оценены несколько партнеров TPR.
В этом анализе вероятно, что некоторые идентифицированные соединения могут быть ложноположительными из-за их вмешательства в технологию анализа, такую как гашение синглетного кислорода, гашение света и рассеяние света. Ложноположительные результаты также могут быть вызваны нарушением связывания метки GST с бусинами донора глутатиона. Этих ложноположительных результатов можно избежать при скрининге молекул как на Hsp90-FKBP51, так и на Hsp90-FKBP52 PPI для выявления селективных ингибиторов. Другие методы обнаружения ИПП также должны применяться для проверки выбранных ингибиторов.
Ограничение нашего анализа заключается в том, что он не может быть использован для обнаружения взаимодействия между Hsp90 и TPR-мотивными ко-шаперонами в сырых биологических образцах, таких как клеточные лизаты. После высокопроизводительного скрининга ингибирование выбранных соединений на Hsp90 - TPR-мотивных ко-шаперонов PPI в биологических образцах должно быть проверено другими методами, такими как коиммунопреципитация и анализ бесконтактного лигирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Шведского исследовательского совета (2018-02843), Фонда мозга (Fo 2019-0140), Фонда гериатрических заболеваний в Каролинском институте, Фонда Гунвора и Йозефа Анерса, Фонда Магнуса Бергваллса, Фонда Гана и Бертиля Стонеса, Фонда медицинских исследований Торе Нильссона, Фонда Маргареты аф Угглас и Фонда старых слуг.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well plates | Perkin Elmer | 6008350 | Assay volume 25 ml |
| Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit | Millipore | UFC901008 | Concentrate protein |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Antibiotics |
| Bacteria shaker Unimax 1010 | Heidolph | Culture bacteria | |
| cDNA clones for human FKBP51 | Source BioScience | clone id: 5723416 | pCMV-SPORT6 vector |
| cDNA clones for human FKBP52 | Source BioScience | clone id: 7474554 | pCMV-SPORT6 vector |
| Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C602003 | One Shot BL21 Star (DE3) |
| Data analysis software | GraphPad Prism | 9.0.0 | Analysis data and make figures |
| Data analysis software | Excel | Analysis data | |
| DMSO | Supelco | 1.02952.1000 | Dilute compounds |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Prepare solution |
| EDTA | Calbiochem | 344504 | Prevent proteolysis during sonication |
| Glutathione | Sigma | G-4251 | Elute GST-tagged proteins |
| Glutathione donor beads | Perkin Elmer | 6765300 | Donor bead |
| GST-trap column | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | Purify GST-tagged proteins |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Induce protein expression |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | Microbial growth medium |
| PCR instrument | BIO-RAD | S1000 Thermal Cycler | Amplification/PCR |
| PD-10 column | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | Solution exchange |
| pGEX-6P-1 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | Plasmid |
| pGEX-6P-2 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | Plasmid |
| Plate reader | Perkin Elmer | EnSpire 2300 Multilabel Reader | Read alpha plate |
| Plate reader software | Perkin Elmer | EnSpire Manager | Plate reader software |
| Plate reader software protocol | Perkin Elmer | Alpha 384-well Low volume | Use this protocol to read plate |
| PMSF | Sigma | P7626 | Prevent proteolysis during sonication |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | S8830 | Prevent proteolysis during sonication |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | As a preservative |
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma | 156159 | Activates matrix for coupling |
| Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform | Peptide 2.0 inc | Synthesize Hsp90 C-terminal peptide | |
| Test-Tube Rotator | LABINCO | Make end-over-end agitation | |
| Tris-HCl | Sigma | 10708976001 | Block unreacted sites of acceptor beads |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | Prevent beads aggregation |
| Ultra centrifuge Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | Centrifuge to get bacteria cell pellets | |
| Ultrasonic cell disruptor | Microson | Sonicate cells to release protein | |
| Unconjugated acceptor beads | Perkin Elmer | 6762003 | Acceptor beads |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module | Invitrogen | EI0002 | SDS-PAGE |
References
- Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
- Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).
- Yuno, A. Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).
- Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer. European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).
- Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).
- Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).
- Scheufler, C., et al. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101 (2), 199-210 (2000).
- Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease. Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).
- Ullman, E. F., et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).
- Wigle, T. J., et al. Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins. Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).
- Guenat, S., et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).
- Sabatucci, A., et al. A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV. Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).
- Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).
- Huang, X., et al. A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan. Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).
- Roger Bosse, C. I., Chelsky, D. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences. , Available from: https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf (2021).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
