片側性腎虚血再灌流傷害の有効マウスモデル

以下のプロトコールは、生存手術について記載する。したがって、最高の無菌および外科的実践が適用される。すべての動物実験は、施設ガイドラインに準拠して実施され、施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された。IRI効果における性別および系統ベースの差異を排除するために、雄のC57BL6マウスのみが研究に使用された。全ての動物を、同等の結果を得るために年齢および体重において一致させた。 1. 準備 注:さまざまな実験段階と介入のタイムラインを 図1Aに示します。 各処置の前に手術台を清掃し、消毒する。必要なすべての材料(滅菌器具および綿棒、滅菌ガーゼおよびドレープ、予め希釈された麻酔薬、加熱パッド、滅菌血管クランプ、滅菌生理食塩水、皮膚消毒剤および縫合糸)を準備し、手術台に置く( 材料表を参照)。 ケタミン/キシラジン(それぞれ100 mg/kgおよび20 mg/kg体重、滅菌生理食塩水で予め希釈)の腹腔内注射により、雄のC57BL6マウス(年齢範囲11〜13週)を麻酔する。注:ストレス応答が麻酔薬の作用に悪影響を及ぼす可能性があるため、動物のストレスを最小限に抑えるには、熟練した動物の取り扱いが不可欠です。 ケタミン/キシラジン投与後、カミソリの刃と石鹸で右脇腹の手術領域を剃ります。注:皮膚を剃ることは、創傷治癒および生存手術の一般的な転帰を改善する。 最初に70%アルコールで手術領域の皮膚を消毒し、次に綿棒を使用してポビドンヨウ素溶液で消毒します。 皮膚の準備後、マウスを腹側褥瘡位置の加熱テーブルの上に置き、体温を37°Cに安定させます(直腸およびパッドセンサープローブを介して監視)。注:腎臓は、側方ではなく腹側の褥瘡に置かれると、より簡単にアクセスでき、外科的に露出します。 体温が安定している間、マウスの目に眼軟膏を塗布する。注:ケタミンなどの解離性麻酔薬は、麻酔をかけている間、動物の目を開いたままにします。 2. 手術 疼痛反射がなくなったら(ピンセットでつま先をつまむ)、メス刃を使用して右脇腹に約1cmの背側外科的切開を行う。最後の肋骨の後ろの切開を開始し、腰椎正中線に平行に約1cm尾方向に続けます。 はさみを使用して腹部筋肉組織を経抜し、後腹膜腔を視覚化する。滅菌綿棒を使用して筋肉の切片化中に生成された少量の血液を除去する。注:背側方アプローチが使用されるため、腹腔ではなく後腹膜にこの手順でアクセスします。 右腎臓を腹腔から押し出します。Graefe鉗子を使用して腎臓を慎重に露出させます。注:腹部に置いたときに腎臓の外傷性損傷を避けるために、鉗子を常に閉じたままにし、腎臓を外科的切開部に向かって慎重に押して導くためにのみ使用してください。 ゆっくりと右の腎臓を露出させ、腎椎帥を識別します。慎重にペディクルの周りの脂肪組織を除去します. 虚血を誘発するには、血管クランプを腎椎弓に存在する腎動脈および静脈の上に置き、隣接する尿管をクランプすることを避ける。血管クランプを操作するためにハルステッドモスキート止血剤を使用してください。注:虚血は、腎臓の色が赤ピンクから濃い紫色に変化したことを視覚化することによって確認されます(図1B)。 乾燥を避けるために生理食塩水に浸した滅菌ガーゼで締め付けた腎臓を覆い、30分間放置する。 この間、ガーゼの麻酔の深さと湿度を定期的に監視します。注:麻酔の誘導用量は、虚血事象の終わりまで鎮痛を提供するのに十分である。したがって、追加の麻酔薬注射は必要ありません。 虚血期間が終わる直前に、ガーゼを取り出し、腎臓を明らかにします。ハルステッドモスキート止血剤を持ち、クランプを取り外す準備をします。 30分で、止血器で血管クランプを開き、腎臓の再灌流を可能にするために腎椎弓根から取り外す。注:再灌流は、腎臓の色が濃い紫色から赤ピンク色に変化したことを視覚化することによって確認されます(図1C)。 腎椎帥を締め付けずに偽の動物について上記と同じ手順を実行します。 腎臓の色の変化を確認した後、腎臓を腹腔に戻します。十字状パターンを用いて吸収可能な縫合糸5-0で腹筋を閉じる。注:筋肉および皮膚の縫合中に鎮痛を維持するために、麻酔薬の2回目の注射が必要な場合があります。初期用量の半分は、手術の終了まで鎮痛を提供するのに有効であることが証明されている。 水平マットレスパターンを使用して吸収性縫合糸5-0で皮膚を閉じる。綿棒を使用してポビドンヨウ素溶液で創傷をきれいにする。 3. 回復と手術後 注:手術後の時間は実際の再灌流時間であるため、適切な手術後のケアは倫理的に必須であり、科学的に関連性があります。再灌流時間は、研究者の要求に応じて選択することができる。4時間、8時間、16時間、1日、2日、4日、および7日の再灌流時間を比較して、腎IRIによって誘導される病理学的変化の逐次的な概要を得る。 マウスが麻酔から回復し始めるまで、マウスを加熱パッドの上に置きます。メモ: マウスが脚を動かし始め、動き回ろうとするまで待つことをお勧めします。手術中に追加の麻酔薬注射が必要な場合、回復時間はより長くなります。α-2受容体アンタゴニストであるアチパメゾールは、キシラジン効果を逆転させ、回復期を短縮するために、腹腔内に0.5mg / kg体重の用量で投与することができる。疼痛管理のために、ブプレノルフィン(体重0.1mg / kg、腹腔内)は、術前および回復期および手術後の段階で6時間ごとに投与される。非ステロイド性抗炎症薬の使用は、このファミリーのいくつかの薬物が腎毒性を誘発し、したがって結果を変える可能性があるため、推奨されない。 麻酔から回復した後、水と食物に自由にアクセスできる状態でマウスをケージに戻します。注:マッシュドフードは、ペトリ皿だけでなく、隠して遊ぶための材料(紙シート、ペーパータオルチューブなど)でも提供できます。 創傷治癒、食物および水分摂取量、体重、および行動を評価するために、マウスを毎日監視する。注:創傷治癒状態は、以下の尺度を用いて評価した:1、乾燥;2、濡れた;3、部分的に開いた。4、開いた。この研究では、迅速な創傷治癒が文書化され、2日目以降に乾燥創傷の90%以上が記録されました。 4. 安楽死とサンプル採取 マウスの麻酔薬用量(100mg / kg)の2倍の用量で腹腔内に投与されたペントバルビタールナトリウムでマウスを安楽死させる。 必要に応じて流体および組織サンプルを収集します。注:腎臓、全血(血球数用)、血清(血液生化学用)、尿、心臓、肺の両方を採取した。血液生化学分析(血中尿素窒素(BUN)、クレアチニン、電解質)には数マイクロリットルの血清が必要です。必要に応じて、安楽死の24時間前に、マウスを代謝ケージに入れて、腎機能パラメータの決定を可能にするより高い尿量を収集することができる。