מודל עכבר יעיל של פגיעה חד-צדדית באיסכמיה-רפרפוזיה של הכליה
Summary
פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה כלייתית קשורה לתחלואה ותמותה גבוהה בחולים מאושפזים. כאן אנו מציגים מודל עכבר פשוט ויעיל של פגיעה חד-צדדית באיסכמיה-רפרפוזיה של הכליה ומספקים סקירה רציפה של שינויים פתולוגיים מייצגים שנצפו בכליה.
Abstract
פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (IRI) היא הגורם המוביל לאי ספיקת כליות חריפה והיא תורמת משמעותית לתפקוד השתלה המושהה. מודלים של בעלי חיים הם המשאבים הזמינים היחידים המחקים את המורכבות של הנזקים הקשורים ל-IRI שנתקלים בהם in vivo. מאמר זה מתאר מודל עכבר יעיל של IRI כלייתי חד-צדדי המספק נתונים הניתנים לשחזור מרבים. איסכמיה מושרית על ידי חסימת פדיקלת הכליות הימנית למשך 30 דקות ולאחר מכן רפרפוזיה. בנוסף להליך הכירורגי, תינתן סקירה רציפה של השינויים הפיזיולוגיים וההיסטופתולוגיים הצפויים בעקבות IRI כלייתי על ידי השוואת נתונים משבעה זמני רפרפוזיה שונים (4 שעות, 8 שעות, 16 שעות, יום אחד, יומיים, 4 ימים ו-7 ימים). נתונים קריטיים לתכנון ניסויים קדימה, כגון זמן ניתוח ממוצע, צריכת הרדמה ממוצעת ושינויים במשקל הגוף לאורך זמן, ישותפו. עבודה זו תסייע לחוקרים ליישם מודל IRI כלייתי אמין ולבחור את זמן ההעתקה המתאים המתאים שיתאים למטרות החקירה המיועדות שלהם.
Introduction
הכליות הן בין האיברים הגבוהים ביותר בגוף והם רגישים מאוד לשינויים בזלוף הדם1. פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה כלייתית (IRI) נותרה הגורם המוביל לאי ספיקת כליות חריפה 2,3 והיא קשורה לתחלואה גבוהה ותמותה גבוהה בחולים מאושפזים4. עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות זמינות,4,5 IRI כלייתי הוא כיום המוקד של מספר מאמצי מחקר בביו-רפואה 6,7 שמטרתם לפתח מטרות טיפוליות חדשניות ולאפיון סמנים מוקדמים ורגישים של פגיעה כלייתית 8,9,10 . זיהוי מודל אמין, בעל חיים אמין וחסכוני נחשב חיוני כדי לענות על צרכים אלה. מאמר זה מציג מודל עכבר פשוט ויעיל של IRI כליות חד צדדי. איסכמיה מושרית על ידי הידוק של פדיקל הכליה הימנית במשך 30 דקות11,12. חלק מכריע במודל זה הוא בחירת זמן הרפרפוזיה המתאים ביותר שישחזר את האירועים הפתולוגיים המעניינים, כגון נמק צינורי, חדירת תאים דלקתיים פולימורפונוקליאריים או פיברוזיס. לכן, החוקרים מסופקים עם סקירה רציפה זו של שינויים פתולוגיים מייצגים הצפויים בכליה IRI.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודלים של IRI כלייתיים של עכברים פופולריים במחקר ביו-רפואי בשל עלויות התפעול הנמוכות יחסית שלהם והזמינות של מודלים מהונדסים מגוונים12. מודל IRI הכליתי החד-צדדי המוצג כאן מחקה שינויים פתולוגיים אופייניים שנצפו ב- IRI כלייתי אנושי כגון התרחבות צינורית, נמק ופיברוזיס13. תוצאות אלה מבוססות על זמני רפרפוזיה משתנים.
שלבים קריטיים של פרוטוקול זה כוללים שמירה על טמפרטורת גוף קבועה ומיקום נכון של מהדק כלי הדם בדוושת הכליות. טמפרטורת הגוף משפיעה על חילוף החומרים של החיה14, ומשנה את תוצאות הניסוי הן ברמה הפיזיולוגית והן ברמה התאית15. במודל זה, טמפרטורת הגוף התייצבה לפני הניתוח באמצעות בדיקות חיישן פי הטבעת והפד. בנוסף, ניטור רציף של טמפרטורת הגוף במהלך כל ההליך הכירורגי מומלץ מאוד, במיוחד לפני הנחת מהדק כלי הדם כדי לגרום איסכמיה.
החשיפה של הכליה והמיקום הנכון של מהדק כלי הדם הם גם קריטיים להצלחת הניסוי. פגיעה בכמוסה הכליתית על ידי טיפול לא נכון במלקחיים במהלך חשיפת הכליה דרך החתך הכירורגי תגרום לדימום פריינלי ולדלקת. יש למקם את מהדק כלי הדם על הפדיקלה הכליתית המסתירה את עורק הכליה ואת וריד הכליה מבלי להשפיע על השופכן ועל העורקים העל-ארציים. קריטי לשלב זה הוא ניתוח זהיר של רקמת השומן המקיפה את הילום הכליתי14,16.
מודל זה משתלם וחסכוני בזמן. הצריכה להרדמה לעכבר הייתה 156.47 ± 37.88 μL (ממוצע ± SD, n = 17) של קוקטייל קטמין/קסילאזין מדולדל מראש (1:10 קטמין, 1:50 קסילאזין, במי מלח; ריכוז תמיסת ציר, 100 מ”ג/מ”ל שניהם). ניתוח יכול להתבצע בתקופה קצרה יחסית. זמן הניתוח הכולל לעכבר היה 53 ± 5.23 דקות (ממוצע ± SD, n = 17). עם כוח אדם מיומן, ניתן לבצע מספר ניתוחים בו זמנית. בקבוצה שלנו, חוקר מנוסה אחד ביצע את הניתוח עד שהמהדק שוחרר מהפדיקל הכליתי, ואילו חוקר שני השתלט על סגירת הפצע עד להחלמת העכבר. עם גישה זו, הצלחנו לבצע מספר גבוה של ניתוחים ביום אחד. במודל זה השתמשנו בגישה הגבית, הגורמת לפחות טראומה והפחתת אובדן נוזלים וחום מחלל הבטן בהשוואה לגישה של קו האמצע16.
פרוטוקולים שפורסמו בעבר תיארו את טכניקת הידוק הפדיקלים הכליתיים כדי לגרום לפגיעה חריפה בכליות בעכברים 17,18,19. עם זאת, במחקרים אלה, בוצעה כריתת נפרקטיקה קונטרה-צדדית בנוסף ל- IRI החד-צדדי עם זמנים איסכמיים הנעים בין 15 ל -26 דקות. בפרוטוקול זה, גרמנו איסכמיה חד-צדדית במשך 30 דקות תוך שמירה על הכליה הקונטרה-צדדית. זה הביא לשיעור הישרדות של 100%. עם זאת, מודל זה אינו מתאים לגרום לנזק כלייתי אזוטמי בשל בחלקו בשל ההשפעה המפצה המופעלת על ידי הכליה למניעת התערבות כירורגית. עם זאת, שמירה על כליה אחת ללא השפעה באותה חיה מציעה את היתרון של שימוש בזמני איסכמיה ארוכים יותר עם שיעור הישרדות גבוה יותר. בנוסף לכך, ניתן להשתמש בכליה הקונטרה-צדדית כדי להעריך תופעות לוואי אפשריות של תרופות בדיקה או טיפולים המיושמים במהלך ההליך הניסיוני ולחקור השפעות צולבות של כליות וכליות 20,21. לדוגמה, מודל זה היה שימושי בהצגת שינויים הנגרמים על ידי מיני חמצן תגובתי ברמה התאית הן ב- IRI והן בכליה קונטרלטרלית, שאינה מתערבת כירורגית11.
למודל זה יש יישום פוטנציאלי במחקרים שמטרתם לזהות ולאפיין סמנים של נזק כלייתי חד-צדדי, השפעות צולבות כלייתיות, שינויים המודינמיים הנגרמים על ידי IRI לאחר הכליה, והשפעות נפרוטוקסיות פוטנציאליות של מועמדים לתרופות שישמשו ב- IRI כלייתי. תיאור מפורט זה של השינויים הפתולוגיים העיקריים משמש ככלי רב ערך לבחירת הזמן המתאים ביותר לחקר תהליכים תאיים ספציפיים, מדלקת ונמק (4 שעות עד יומיים) ועד התחדשות (4 ימים) ופיברוזיס (7 ימים ואילך).
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
חלק מהעבודה המוצגת במאמר זה נוסדה על ידי המרכז לחקר יונקים אינטגרטיביים בבית הספר לרפואה וטרינרית של אוניברסיטת רוס (RUSVM), סנט קיטס ונוויס. הסיוע הכספי הניתן על ידי המחלקה למדעים ביו-רפואיים וטרינריים של המכללה לרפואה וטרינרית של אוניברסיטת לונג איילנד מוערך מאוד.
Materials
| Atipamezole hydrochloride | Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA | PVS8700 | 5 mg/mL |
| Buprenorphine | Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA | PRMBURPEN22 | 0.3 mg/mL |
| Commercial euthanasia solution | various suppliers | na | e.g., Euthasol Virbac (sodium pentobarbital 390 mg/mL + sodium phenytoin 50 mg/mL) |
| Eye ointment Puralube | Dechra Veterinary Products, KS, USA | na | 3.5 g (1/8 oz) |
| Heating pad RightTempJr | Kent Scientific, CT, USA | RT-JR-20 | Consider the one with two temperature probes |
| Ketamine hydrochloride | Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA | VED1220 | 100 mg/ml |
| S&T Vascular clamp | Fine Science Tools, Inc., Germany | 00398-02 | Jaw dimensions: 5.5 x 1.5 mm; length: 11 mm |
| Sterile Disposable Towel Drapes | Kent Scientific, CT, USA | SURGI-5023-3 | Disposable, individualy packed |
| Surgical instruments (Graefe forceps, Halsted-Mosquito hemostat, scissors, etc) | Fine Science Tools, Inc., Germany | Various | Consider the extra fine straight scissor and the angled Graefe forceps |
| Vicryl suture | Ethicon US, LLC | J493G | Size 5-0 |
| Xylazine hydrochloride | Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA | VAM4821 | 100 mg/mL |
Referências
- Ray, S. C., Mason, J., O’Connor, P. M. Ischemic renal injury: can renal anatomy and associated vascular congestion explain why the medulla and not the cortex is where the trouble starts. Seminars in Nephrology. 39 (6), 520-529 (2019).
- Weight, S. C., Bell, P. R., Nicholson, M. L. Renal ischaemia–reperfusion injury. The British Journal of Surgery. 83 (2), 162-170 (1996).
- Ratliff, B. B., Abdulmahdi, W., Pawar, R., Wolin, M. S. Oxidant mechanisms in renal injury and disease. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (3), 119-146 (2016).
- Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. Acute renal failure: definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy. The Journal of Clinical Investigation. 114 (1), 5-14 (2004).
- Fernández, A. R., Sánchez-Tarjuelo, R., Cravedi, P., Ochando, J., López-Hoyos, M. Review: Ischemia reperfusion injury-a translational perspective in organ transplantation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8549 (2020).
- Wu, C. -. L., et al. Tubular peroxiredoxin 3 as a predictor of renal recovery from acute tubular necrosis in patients with chronic kidney disease. Scientific Reports. 7 (1), 43589 (2017).
- Nishida, K., et al. Systemic and sustained thioredoxin analogue prevents acute kidney injury and its-associated distant organ damage in renal ischemia reperfusion injury mice. Scientific Reports. 10 (1), 20635 (2020).
- Mishra, J., et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a biomarker for acute renal injury after cardiac surgery. Lancet. 365 (9466), 1231-1238 (2005).
- Han, W. K., Bailly, V., Abichandani, R., Thadhani, R., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 (KIM-1): A novel biomarker for human renal proximal tubule injury. Kidney International. 62 (1), 237-244 (2002).
- Coca, S. G. Kidney injury biomarkers with clinical utility: has Godot finally arrived. American Journal of Nephrology. 50 (5), 357-360 (2019).
- Godoy, J. R., et al. Segment-specific overexpression of redoxins after renal ischemia and reperfusion: protective roles of glutaredoxin 2, peroxiredoxin 3, and peroxiredoxin 6. Free Radical Biology & Medicine. 51 (2), 552-561 (2011).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).
- Gaut, J. P., Liapis, H. Acute kidney injury pathology and pathophysiology: a retrospective review. Clinical Kidney Journal. 14 (2), 526-536 (2021).
- Le Clef, N., Verhulst, A., D’Haese, P. C., Vervaet, B. A. Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice. PLoS One. 11 (3), 0152153 (2016).
- Pelkey, T. J., et al. Minimal physiologic temperature variations during renal ischemia alter functional and morphologic outcome. Journal of Vascular Surgery. 15 (4), 619-625 (1992).
- Kennedy, S. E., Erlich, J. H. Murine renal ischaemia-reperfusion injury. Nephrology. 13 (5), 390-396 (2008).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (78), e50495 (2013).
- Hesketh, E. E., et al. Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51816 (2014).
- Wei, J., et al. New mouse model of chronic kidney disease transitioned from ischemic acute kidney injury. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 286-295 (2019).
- Basile, D. P., Leonard, E. C., Tonade, D., Friedrich, J. L., Goenka, S. Distinct effects on long-term function of injured and contralateral kidneys following unilateral renal ischemia-reperfusion. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 302 (5), 625-635 (2012).
- Polichnowski, A. J., et al. Pathophysiology of unilateral ischemia-reperfusion injury: importance of renal counterbalance and implications for the AKI-CKD transition. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (5), 1086-1099 (2020).
