Zebra balığı kalbinin in vivo ışık tabakası floresan mikroskopisi ile incelenmesi için optimize edilmiş araçlar açıklıyoruz. Özellikle, parlak kardiyak transgenik çizgiler öneriyoruz ve gelişimsel ve kalp kusurlarını önleyen yeni nazik gömme ve hareketsizleştirme teknikleri sunuyoruz. Kardiyak görüntülemeye uyarlanmış olası bir veri toplama ve analiz boru hattı da sağlanmaktadır.
Embriyonik kardiyak araştırmalar, hızlı in vivo ışık tabakası floresan mikroskopislerindeki (LSFM) gelişmelerden büyük ölçüde yararlanmıştır. Zebra balığı Danio rerio’nun hızlı dış gelişimi, çekişli genetiği ve yarı saydamlığı ile birlikte LSFM, önemli bir fototoksiklik veya fotobleaching olmadan yüksek mekansal ve zamansal çözünürlükte kardiyak form ve işlev hakkında içgörüler sunmuştur. Atan kalplerin görüntülenmesi, mevcut numune hazırlama ve mikroskopi tekniklerine meydan okuyor. Kalp atışını çözmek için daralmış bir görüş alanında sağlıklı bir örnek elde etmek ve ultra hızlı görüntüler elde etmek gerekir. Burada zebra balığı kalbini vivo incelemek için optimize edilmiş araçları ve çözümleri açıklıyoruz. Kardiyak bileşenleri etiketlemek için parlak transgenik çizgilerin uygulamalarını gösteriyoruz ve gelişimsel kusurları ve kalp atış hızındaki değişiklikleri önleyen yeni nazik gömme ve hareketsizleştirme teknikleri sunuyoruz. Ayrıca kardiyak görüntülemeye uyarlanmış bir veri toplama ve analiz boru hattı öneriyoruz. Burada sunulan tüm iş akışı zebra balığı embriyonik kalp görüntülemesine odaklanır, ancak diğer çeşitli örneklere ve deneylere de uygulanabilir.
Erken atan kalpteki karmaşık olayları ve etkileşimleri ortaya çıkarmak için tüm organın in vivo görüntülemesi gerekir. Minimal fototoksisitesi1,2,3, düşük fotobleaching4 ve yüksek hızı ile ışık tabakası mikroskopisi embriyonik ve kardiyak gelişim için birincil görüntüleme aracı olarak gelişti5,6. Yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte kardiyak form ve işlev hakkında içgörüler sunmuştur7,8,9 ve araştırmacıların kalbin floresan etiketli kısımlarını yüksek hızda görüntülemelerine ve izlemelerine, hemodinamik kuvvetleri incelemelerine ve kalp gelişimini doğrudan gelişmekte olan embriyoların vücudunun içinde takip etmelerine izin verdi6,10,11,12.
Zebra balıklarını görüş alanında hassas ve tekrar tekrar kısıtlamak için, kısa ve uzun vadede ışık tabakası için çeşitli gömme protokollerinin yanı sıra tek veya çoklu örnek13,14,15,16,17,18,19 vardır. En yaygın protokol, trikain hareketsizleştirme ve bir cam veya plastik tüpün içine agarose montajını içerir. Bununla birlikte, kullanılan sıcaklık, anestezikler ve gömme malzemesi nedeniyle kalp atış hızı değişebildiği için zebra balığı kardiyak görüntüleme, numune sağlığını sağlamak için özel, nazik protokoller gerektirir6,8,11,12,20,21,22,23 . Kısa süreli görüntüleme için (bir saate kadar), bir 130 mg / L trikainde balığı uyuşturabilir ve Weber ve ark. 201416’da açıklandığı gibi% 0.1 agarose çözeltisi ve bir fiş ile Florlu Etilen Propilen (FEP) tüplerine gömebilir. Bununla birlikte, trikain gelişimsel kusurlara yol açabileceği için20,22, uzun süreli görüntüleme için farklı protokoller kullanılmalıdır.
Burada uzun süreli kardiyak görüntüleme için yeni bir strateji açıklıyoruz. Birçok ışık sayfası uygulaması mevcut24 olsa da, bir T-SPIM mikroskopunda asılı bir örnek kullanmanızı öneririz (numune ortak odakta dikey olarak asılıyken yatay bir düzlemde bir algılama ve iki aydınlatma lensi). Bu, hassas numune konumlandırması için gerekli hareket ve dönüş özgürlüğünü sağlar. Balıklar, bir veya iki hücreli aşamada 30 pg α-bungarotoxin mRNA enjekte ederek hareketsiz hale getirilir. α-bungarotoksin, kardiyovasküler gelişimi veya fizyolojiyi etkilemeden kasları felç eden bir yılan zehiridir22. Hassas, bozulmadan görüntüleme için, balıkların suyla neredeyse aynı kırma indeksine sahip bir polimer olan FEP’den yapılmış tüplere monte etmenizi öneririz. FEP tüplerini görüntülemeden önce düzleştirip temizleyerek en iyi şekilde nasıl hazırlayacağımızı tartışıyoruz. Balıklar daha sonra bu tüplere monte edilir, baş aşağı, medyada ve tüpün tabanı, balık kafalarının dayandığı% 2 agarose fişi ile kapatılır. FEP tüpündeki deliklerin kesilmesi gaz değişimini kolaylaştırır ve balık büyümesini sağlar. Gömülü balık, görüntülemeden hemen önce bir numune tutucuya monte edilene kadar medyada tutulabilir. Ayrıca, tekrarlanabilir yüksek hızlı görüntüleme için bir veri toplama ve analiz boru hattı öneriyoruz. Ayrıca, sağlam kalp hücresi etiketlemesi için sitoplazmik ve membran işaretleyici transgenik çizgilerin kullanımını ve kalbi durdurmak için farklı seçenekleri tartışıyoruz. Bu montaj teknikleri, kalbi görüş alanında hassas ve tekrarlanabilir bir şekilde kısıtlamaya izin verirken örnek sağlığı sağlar.
Kalbi görüntüleyen transgenik çizgiler
Şekil 6: Sitoplazmik ve membran işaretleyici zebra balığı transgenik çizgilerinin karşılaştırılması. LSFM ile görüntülenen 48 hpf zebra balığı kalbinin ön-ventral görünümü. Beyaz oklar, yalnızca membran işaretleyici transgenik çizgi ile görülebilen yapıları gösterir. (a) Tg(kdrl:EGFP)Kalpte siyanda 32 sinyali ve ventrikülde (a’) . (b) Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 sinyal kalpte kırmızı ve (b’) ventrikülde. ( c,c’) hem Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) hem de Tg(kdrl:EGFP) sinyalinin birleştirilmesi. Ölçek çubuğu 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Zebra balığı kalbinin görüntülenmesi hassas kalp hücresi etiketlemesi gerektirir. Miyokard kalınlığı hücreler boyunca nispeten sabit olsa da, endokardiyal hücreler çekirdeğin etrafında kalındır, ancak bazı bölgelerde 2 μm’den daha ince ince membran çıkıntılarına sahiptir. Tg(kdrl:EGFP)32 gibi sitoplazmik transgenik çizgiler endokardiyal çekirdek çevresindeki bölgeleri etkili bir şekilde etiketlemektedir, ancak daha uzakta, ince sitoplazma bu kadar kısa maruz kalma süreleri ile tespit edilecek kadar foton yaymayabilir ve bu da verilerde yapay deliklere yol açabilir (Şekil 6a). Buna karşılık, Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 gibi membran işaretleyici transgenik çizgiler endokardiumu etkili bir şekilde etiketleyebilir ve daha fazla ayrıntı ortaya çıkabilir (Şekil 6b,c). Her deney için en uygun transgenik çizgiyi dikkatlice seçin.
Zebra balığı hareketsizleştirme
Hareketsizleştirme tekniğinin seçimi, deneyin uzunluğuna ve balığın görüntülenme yaşına bağlıdır. Trikain, çoğunlukla kullanım kolaylığı nedeniyle zebra balığı hareketsizleştirme için yaygın olarak kullanılmıştır. Gerçekten de, balık medyasına sadece 130 mg / L trikain eklemek, 10 dakika içinde anestezi almalarıyla sonuçlanır. Gelişimsel kusurlara yol açabileceğinden ve kalp fizyolojisini etkileyebileceğinden20,22, trikaini sadece kısa deneyler için (30 dakikadan az) kullanmanızı öneririz. Daha uzun görüntüleme için, bir veya iki hücreli aşamada α-bungarotoxin mRNA enjeksiyonları, kardiyovasküler gelişimi veya fizyolojiyi etkilemeden döllenme sonrası (dpf) 3 güne kadar balıkları felç eder22.
Doğru FEP tüplerini seçme
FEP tüpleri çeşitli çap ve kalınlıklarda mevcuttur. Görüntü için 0-5 dpf balık, 0.8 mm iyi bir iç çaptır; kalın duvar 0,8 x 1,6 mm tüpler veya ince duvar 0,8 x 1,2 mm tüpler seçin. İnce duvarlı tüpler öneriyoruz; bununla birlikte, daha kalın duvarlar daha fazla stabilite ve sertlik sunar, bu da numune odasının ince bir tüpü bozabilecek ve hareket ettirebilecek akan ortama sahip olması durumunda önemli olabilir. Daha büyük numuneler için 1,6 x 2,4 mm ve 2 x 3 mm kullanılabilir.
Sıcaklık ve gaz değişimleri
Zebra balığı embriyosunun refahının önemli bir yönü sıcaklıktır. İdeal olarak, çevrenin sıcaklığı gelişimi ve kalp atış hızını etkilediği için görüntüleme sırasında balığı 28,5 °C’de tutun34.
Deneyimlerimize göre, % 2 agarose fişi ile oksijen değişimi sadece 3-4 dpf’ye kadar istikrarlı bir kalp atış hızını korur. Bu nedenle, tüpteki deliklerin kesilmesi oksijen difüzyonunu sağlar. İstenirse numuneye ilaç verilmesi için de gerekli olabilir.
Kalp atışının askıya alınması.
Uygun şekilde donatılmış ışık sac mikroskoplarının hızlı alım hızları, atan kalbin in vivo olarak kaydedilmesini sağlar. Bununla birlikte, bozulmamış bir z-yığını elde etmek için kalbi yavaşlatabilir veya durdurabilir. Bununla birlikte, kalbi durdurmak kalp kasının gevşemesine yol açar ve kalbin çökmesine neden olabilir6. Kalp atışı süspansiyonu morfolinolar, düşük sıcaklıklar, kas kasılmasının bir inhibitörü veya optogenetik kullanılarak yapılabilir. Bu yöntemlerin her birinin dezavantajları vardır ve her deney için dikkatlice değerlendirilmelidir.
Tek hücre aşamasında 4 ng sessiz kalp (sih) morfotin enjeksiyonu sarkom oluşumu için çok önemli olan tnnt2a genini hedef alarak kalp atışını durdurabilir35. sih zebra balığı kalp atışına sahip değildir ve embriyolar oksijenlenme için dolaşımdaki kanlara güvenmeye başladığında sadece 7 dpf’ye kadar hayatta kalır. Kalp morfogenezi hem genetik hem de biyomekanik kuvvetler tarafından yönlendirilirken36, bu balıklar 3 dpf civarında kalp malformasyonları sunar.
Ca2+‘nın akışı sıcaklığa duyarlı olduğundan, sıcaklık embriyonik zebra balıklarında kalp atış hızını etkiler21. Sonuç olarak, görüntüleme odasındaki sıcaklığı düşürmek kalp atışını yavaşlatır. Kalp atışını durdurmak için 15 °C’nin altındaki sıcaklıklar gerekir. Zebra balıkları genellikle 28,5 °C’de tutulduğu için, bu tür düşük sıcaklıklar sadece kısa süreler boyunca (10 dakikadan az) tutulabilir.
Kalp atışını geçici olarak askıya almak için zebra balığı ortamına (50 nM37,38) 2,3-Bu-tanedione 2-monoxime (BDM) gibi kas kasılmalarının kimyasal inhibitörleri gibi ilaçlar eklenebilir. BDM, kalp kasılmalarını 15 dakikadan daha az bir sürede durdurduğu ve kalp fonksiyonunu geri kazanmak için yıkanabildiği için kullanımı uygundur. Bununla birlikte, BDM kardiyak etki potansiyelini değiştirdiğinden, dikkatli kullanılmalıdır37.
Son olarak, miyokardlarında ışık kapılı iyon kanallarını veya channelrhodopsin veya halorhodopsin gibi pompaları ifade eden transgenik zebra balıklarının kalbi, giriş kanalındaki kalp pili ışık39,7,40,41,9 ile aydınlatılarak manipüle edilebilir ve durdurulabilir.
Outlook
Zebra balığı kalp in vivo incelemek için sunulan optimize edilmiş araçlar ve çözümler, ultra hızlı kardiyak dinamiklerin uzun vadeli, nazik bir şekilde görüntülenmesini sağlar. Örnek gömme, konfokal mikroskopi, iki fotonlu mikroskopi veya optik projeksiyon tomografisi (OPT) gibi farklı görüntüleme yöntemlerine uyacak şekilde uyarlanabilir. Bununla birlikte, ışık tabakası mikroskopisi, muhtemelen kalbin dinamiklerini yakalamak için yeterli bir hızda optik kesit sunan tercih edilen tekniktir. Bu protokol zebra balığı embriyonik kalp görüntülemeye odaklanırken, diğer çeşitli örneklere ve deneylere de uygulanabileceğini inanıyoruz. Gelecekte, kalbin daha gizli ve larvaların daha az yarı saydam olduğu gelişim sırasında benzer gömme ve görüntüleme tekniklerinin de kullanılıp kullanılamayacağı ilginç olacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Şekil 2h’deki illüstrasyon için Madelyn Neufeld’e teşekkür ederiz. Bu çalışma Max Planck Society, Morgridge Araştırma Enstitüsü, Chan Zuckerberg Girişimi ve İnsan Sınırı Bilim Programı (HFSP) tarafından desteklendi.
1.5mL Eppendorf | Eppendorf | 22364111 | To carry embedded samples |
15mL Falcon tubes | Falcon | 352095 | To carry embedded samples |
50mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes |
50mL syringe | BD | 309654 | 50ml syringe for FEP cleaning |
Agarose, low gelling temperature | Sigma Aldrich | 39346-81-1 | To make plug |
Blunt Tip Needles, 21 gauge | VWR | 89500-304 | Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K33 | Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K31 | Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Conventional needles, 21 Gauge | BD | 305165 | Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Disposable glass pipette | Grainger | 52NK56 | To transfer fish, use with pipette pump |
E3 medium for zebrafish embryos | |||
Ethanol | Sigma Aldrich | 64-17-5 | Ethanol for FEP cleaning |
FEP tube, 0.8 / 1.2 mm | ProLiquid | 2001048 | FEP tube with thick wall, other sizes available |
FEP tube, 0.8 / 1.6 mm | Bola | S1815-04 | FEP tube with thin wall, other sizes available |
FEP tube, 2/3mm | BGB | 211581 | Large FEP tube with thick wall, other sizes available |
Hot Hand Rubber Mitt | Cole-Parmer | 691000 | To carry hot equipment after autoclaving |
Omnifix 1mL Syringes | B Braun | 9161406V | 1ml syringe for embedding |
Petri dish, small | Dot Scientific | PD-94050 | To make agarose plug |
Pipette pumps | Argos Technologies | 04395-05 | To transfer fish, use with disposable glass pipette |
PTU | Sigma Aldrich | 103-85-5 | Also known as: N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide |
Razor blades | Azpack | 11904325 | To cut FEP tubes |
Sodium Hydroxide | Dot Scientific | DSS24000 | NaOH for FEP cleaning |
Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | Also known as: MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine |