Describimos herramientas optimizadas para estudiar el corazón de pez cebra in vivo con microscopía de fluorescencia de lámina de luz. Específicamente, sugerimos líneas transgénicas cardíacas brillantes y presentamos nuevas técnicas suaves de incrustación e inmovilización que evitan defectos de desarrollo y cardíacos. También se proporciona una posible línea de adquisición y análisis de datos adaptada a las imágenes cardíacas.
La investigación cardíaca embrionaria se ha beneficiado enormemente de los avances en la microscopía de fluorescencia de lámina de luz rápida in vivo (LSFM). Combinado con el rápido desarrollo externo, la genética tratable y la translucidez del pez cebra, Danio rerio, LSFM ha proporcionado información sobre la forma y función cardíaca a alta resolución espacial y temporal sin fototoxicidad significativa o fotoblanqueo. Las imágenes de corazones que laten desafían las técnicas existentes de preparación de muestras y microscopía. Uno necesita mantener una muestra saludable en un campo de visión restringido y adquirir imágenes ultrarrápidas para resolver los latidos del corazón. Aquí describimos herramientas y soluciones optimizadas para estudiar el corazón del pez cebra in vivo. Demostramos las aplicaciones de líneas transgénicas brillantes para etiquetar los componentes cardíacos y presentamos nuevas técnicas suaves de incrustación e inmovilización que evitan defectos de desarrollo y cambios en la frecuencia cardíaca. También proponemos una línea de adquisición y análisis de datos adaptada a la imagen cardíaca. Todo el flujo de trabajo presentado aquí se centra en las imágenes del corazón embrionario del pez cebra, pero también se puede aplicar a varias otras muestras y experimentos.
Para descubrir los eventos complejos y las interacciones en el corazón que late temprano, se requieren imágenes in vivo de todo el órgano. Con su mínima fototoxicidad1,2,3, bajo fotoblanqueo4 y alta velocidad, la microscopía de lámina de luz ha evolucionado como la principal herramienta de imagen para el desarrollo embrionario y cardíaco5,6. Ha proporcionado información sobre la forma y la función cardíaca a una alta resolución espacial y temporal7,8,9 y ha permitido a los investigadores obtener imágenes y rastrear partes del corazón marcadas fluorescentemente a alta velocidad, estudiar las fuerzas hemodinámicas y seguir el desarrollo del corazón directamente dentro del cuerpo de los embriones en desarrollo6,10,11,12.
Para restringir de manera precisa y reproducible el pez cebra en el campo de visión, existen una variedad de protocolos de incrustación para láminas ligeras, a corto y largo plazo, así como una sola o múltiple muestra13,14,15,16,17,18,19. El protocolo más común implica la inmovilización de tricaína y el montaje de agarosa dentro de un tubo de vidrio o plástico. Sin embargo, como la frecuencia cardíaca puede cambiar debido a la temperatura, los anestésicos y el material de incrustación utilizado20,21,22, las imágenes cardíacas del pez cebra requieren protocolos específicos y suaves para garantizar la salud de la muestra6,8,11,12,20,21,22,23 . Para imágenes a corto plazo (hasta una hora), se puede anestesiar el pescado en 130 mg / L de tricaína e incrustarlo en tubos de etileno propileno fluorado (FEP) con solución de agarosa al 0.1% y un tapón, como se describe en Weber et al. 201416. Sin embargo, como la tricaína puede conducir a defectos de desarrollo20,22, se deben utilizar diferentes protocolos para la obtención de imágenes a largo plazo.
Aquí describimos una nueva estrategia para la obtención de imágenes cardíacas a largo plazo. Si bien existen muchas implementaciones de hojas de luz24, recomendamos usar una muestra colgante en un microscopio T-SPIM (una detección y dos lentes de iluminación en un plano horizontal con la muestra colgando verticalmente en el foco común). Esto proporciona la libertad de movimiento y rotación necesaria para el posicionamiento preciso de la muestra. Los peces se inmovilizan inyectando 30 pg α-bungarotoxin mRNA en la etapa de una o dos células. α-bungarotoxina es un veneno de serpiente que paraliza los músculos sin afectar el desarrollo cardiovascular ni la fisiología22. Para obtener imágenes precisas y sin distorsión, recomendamos montar peces en tubos hechos de FEP, un polímero con un índice de refracción casi idéntico al agua. Discutimos cómo preparar mejor los tubos FEP enderezándolos y limpiándolos antes de la toma de imágenes. Los peces se montan en estos tubos, con la cabeza hacia abajo, en medios, y la parte inferior del tubo se sella con un tapón de agarosa al 2%, sobre el que descansan las cabezas de los peces. Los orificios de corte en el tubo FEP facilitan el intercambio de gases y aseguran el crecimiento de los peces. El pez incrustado se puede mantener en medios hasta que se monta en un soporte de muestra justo antes de la toma de imágenes. También sugerimos una canalización de adquisición y análisis de datos para imágenes reproducibles de alta velocidad. Además, discutimos el uso de líneas transgénicas de marcadores citoplasmáticos versus marcadores de membrana para el etiquetado robusto de células cardíacas, así como diferentes opciones para detener el corazón. Estas técnicas de montaje aseguran la salud de la muestra al tiempo que permiten restringir el corazón de manera precisa y reproducible en el campo de visión.
Líneas transgénicas para obtener imágenes del corazón
Figura 6: Comparación de líneas transgénicas de pez cebra marcadores citoplasmáticos y de membrana. Vista ventral anterior de corazones de pez cebra de 48 hpf fotografiados con LSFM. Las flechas blancas indican estructuras visibles solo con una línea transgénica marcadora de membrana. a) Señal Tg(kdrl:EGFP)32 en cian en el corazón y (a’) en el ventrículo. (b) Señal Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 en rojo en el corazón y (b’) en el ventrículo. ( c,c’) fusión de la señal Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) y Tg(kdrl:EGFP). Barra de escala 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La obtención de imágenes del corazón del pez cebra requiere un etiquetado preciso de las células cardíacas. Mientras que el grosor del miocardio es relativamente constante en todas las células, las células endocárdicas son gruesas alrededor del núcleo pero tienen protuberancias de membrana delgadas, en algunas regiones más delgadas que 2 μm. Las líneas transgénicas citoplasmáticas como Tg(kdrl:EGFP)32 etiquetan eficazmente las regiones alrededor de los núcleos endocárdicos, pero más lejos, el citoplasma delgado podría no emitir suficientes fotones para ser detectado con tiempos de exposición tan cortos, lo que lleva a agujeros artificiales en los datos (Figura 6a). Por el contrario, las líneas transgénicas de marcadores de membrana como Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 pueden etiquetar eficazmente el endocardio y revelar más detalles (Figura 6b,c). Para cada experimento, elija cuidadosamente la línea transgénica más adecuada.
Inmovilización del pez cebra
La elección de la técnica de inmovilización depende de la duración del experimento y la edad del pez a fotografiar. La tricaína se ha utilizado comúnmente para la inmovilización del pez cebra, principalmente debido a su facilidad de uso. De hecho, simplemente agregando 130 mg / L de tricaína a los medios de peces da como resultado su anestesia en 10 min. Como puede conducir a defectos del desarrollo y afectar la fisiología del corazón20,22, recomendamos usar tricaína solo para experimentos cortos (menos de 30 min). Para imágenes más largas, las inyecciones de ARNm de α-bungarotoxina en la etapa de una o dos células paralizan a los peces hasta 3 días después de la fertilización (dpf) sin afectar el desarrollo cardiovascular o la fisiología22.
Elegir los tubos FEP adecuados
Los tubos FEP están disponibles en varios diámetros y espesores. Para obtener imágenes de peces de 0-5 dpf, 0.8 mm es un buen diámetro interior; elija tubos de pared gruesa de 0,8 x 1,6 mm o tubos de pared delgada de 0,8 x 1,2 mm. Recomendamos tubos de paredes delgadas; sin embargo, las paredes más gruesas ofrecen una mayor estabilidad y rigidez, lo que puede ser importante si la cámara de muestra tiene medios fluidos que podrían interrumpir y mover un tubo delgado. Para muestras más grandes, se pueden utilizar 1,6 x 2,4 mm y 2 x 3 mm.
Intercambios de temperatura y gases
Un aspecto esencial del bienestar del embrión de pez cebra es la temperatura. Idealmente, mantenga a los peces a 28.5 ° C mientras toma imágenes, ya que la temperatura del ambiente afecta el desarrollo y la frecuencia cardíaca34.
En nuestra experiencia, el intercambio de oxígeno a través del tapón de agarosa al 2% solo mantiene una frecuencia cardíaca estable hasta 3-4 dpf. Por lo tanto, cortar agujeros en el tubo asegura la difusión de oxígeno. También puede ser necesario para la administración de medicamentos a la muestra si se desea.
Suspensión de los latidos del corazón.
Las rápidas velocidades de adquisición de los microscopios de lámina de luz adecuadamente equipados permiten registrar el corazón latiendo in vivo. Sin embargo, para adquirir una pila z no perturbada, uno puede ralentizar o detener el corazón. Sin embargo, detener el corazón conduce a la relajación del músculo cardíaco y puede resultar en el colapso del corazón6. La suspensión de los latidos del corazón se puede hacer mediante el uso de morfolinos, bajas temperaturas, un inhibidor de la contracción muscular u optogenética. Cada uno de estos métodos tiene sus inconvenientes y debe evaluarse cuidadosamente para cada experimento.
La inyección de 4 ng de morfolino cardíaco silencioso (sih) en la etapa de una célula puede detener los latidos del corazón al dirigirse al gen tnnt2a crucial para la formación de sarcómeros35. El pez cebra sih no tiene latidos cardíacos y solo sobrevive hasta 7 dpf, cuando los embriones comienzan a depender de la sangre circulante para la oxigenación. Como la morfogénesis cardíaca es impulsada por fuerzas genéticas y biomecánicas36, estos peces presentan malformaciones cardíacas alrededor de 3 dpf.
Como el flujo de Ca2+ es sensible a la temperatura, la temperatura influye en la frecuencia cardíaca en el pez cebra embrionario21. En consecuencia, bajar la temperatura en la cámara de imágenes ralentiza los latidos del corazón. Detener los latidos del corazón requiere temperaturas inferiores a 15 °C. Como el pez cebra generalmente se mantiene a 28.5 ° C, tales temperaturas bajas solo se pueden mantener durante períodos breves (menos de 10 minutos).
Los fármacos como los inhibidores químicos de las contracciones musculares, la 2,3-Bu-tanediona 2-monoxima (BDM), se pueden añadir a los medios del pez cebra (50 nM37,38) para suspender temporalmente los latidos del corazón. BDM es conveniente de usar, ya que detiene la contracción del corazón en menos de 15 minutos y se puede lavar para restaurar la función cardíaca. Sin embargo, como la BDM altera el potencial de acción cardíaca, debe utilizarse con precaución37.
Finalmente, el corazón del pez cebra transgénico que expresa canales iónicos dependientes de luz o bombas como la canalrodopsina o la halorhodopsina en su miocardio puede manipularse y detenerse iluminando el marcapasos en el tracto de entrada con luz39,7,40,41,9.
Perspectiva
Las herramientas y soluciones optimizadas presentadas para estudiar el corazón del pez cebra in vivo permiten obtener imágenes suaves a largo plazo de la dinámica cardíaca ultrarrápida. La incrustación de la muestra se puede adaptar para adaptarse a diferentes modalidades de imagen, como la microscopía confocal, la microscopía de dos fotones o la tomografía de proyección óptica (OPT). La microscopía de hoja de luz, sin embargo, es probablemente la técnica preferida que ofrece seccionamiento óptico a una velocidad suficiente para capturar la dinámica del corazón. Si bien este protocolo se centra en las imágenes del corazón embrionario del pez cebra, creemos que también podría aplicarse a varias otras muestras y experimentos. Será interesante ver en el futuro si también se pueden usar técnicas similares de incrustación e imágenes en etapas posteriores durante el desarrollo, cuando el corazón está más oculto y la larva menos translúcida.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Madelyn Neufeld por la ilustración de la Figura 2h. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Max Planck, el Instituto Morgridge para la Investigación, la Iniciativa Chan Zuckerberg y el Programa de Ciencia de frontera humana (HFSP).
1.5mL Eppendorf | Eppendorf | 22364111 | To carry embedded samples |
15mL Falcon tubes | Falcon | 352095 | To carry embedded samples |
50mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes |
50mL syringe | BD | 309654 | 50ml syringe for FEP cleaning |
Agarose, low gelling temperature | Sigma Aldrich | 39346-81-1 | To make plug |
Blunt Tip Needles, 21 gauge | VWR | 89500-304 | Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K33 | Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K31 | Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Conventional needles, 21 Gauge | BD | 305165 | Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Disposable glass pipette | Grainger | 52NK56 | To transfer fish, use with pipette pump |
E3 medium for zebrafish embryos | |||
Ethanol | Sigma Aldrich | 64-17-5 | Ethanol for FEP cleaning |
FEP tube, 0.8 / 1.2 mm | ProLiquid | 2001048 | FEP tube with thick wall, other sizes available |
FEP tube, 0.8 / 1.6 mm | Bola | S1815-04 | FEP tube with thin wall, other sizes available |
FEP tube, 2/3mm | BGB | 211581 | Large FEP tube with thick wall, other sizes available |
Hot Hand Rubber Mitt | Cole-Parmer | 691000 | To carry hot equipment after autoclaving |
Omnifix 1mL Syringes | B Braun | 9161406V | 1ml syringe for embedding |
Petri dish, small | Dot Scientific | PD-94050 | To make agarose plug |
Pipette pumps | Argos Technologies | 04395-05 | To transfer fish, use with disposable glass pipette |
PTU | Sigma Aldrich | 103-85-5 | Also known as: N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide |
Razor blades | Azpack | 11904325 | To cut FEP tubes |
Sodium Hydroxide | Dot Scientific | DSS24000 | NaOH for FEP cleaning |
Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | Also known as: MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine |