Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Aşağıda özetlenen deney hayvanlarını içeren tüm prosedürler, Kanada Hayvan Bakım Konseyi tarafından yönetilen Manitoba Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Prosedür kurulumu ve hazırlanması NOT: Kuyruk damarı kateter enjeksiyonu için aşağıdaki öğeler gereklidir: insülin şırıngaları, 15 cm’lik pe10 boru parçası, 30 G iğne, gazlı bez, salin, forseps, yeşil floresan dektran boyası, pense ve makas. Ayrıca, görüntüleme seansından önce enjekte edilecek ketamin/ksilazine anestezi ile bir iğne hazırlayın. KRİtİk: Adım 1 ve 2’deki tüm malzeme ve ekipmanlar, etanol ile otomatik olarak kapatılarak veya durulanarak kullanılmadan önce sterilize edilmelidir. Pense düzgün bir şekilde sterilize edilemezse, bir çift büyük iğne tutucu kullanılması önerilir. Kateter tertibatı, kazara iğne delinmelerini önlemek için pense ve tokmaklarla yapılmalıdır. Yaklaşık 15-20 cm Polietilen Boru, PE10 (I.D. 28 mm; O.D. 61 mm). 27 G’lık bir insülin şırıngasını% 0.9 salin ile doldurun ve şırınganın iğnesini polietilen tüpün ucuna bağlayın. Sızıntı olmadığından emin olmak için salinleri tüpten itin. Pense kullanarak, 30 G’lık bir iğneyi (0,3 mm x 25 mm) merkezden kopana kadar ileri geri bükün. İğne bükülmeden temiz olmalıdır. İğneyi tokmaklarla tutarak, iğneyi salin dolu şırıngaya tutturulmuş PE10 borunun ucuna dikkatlice yerleştirin ve hava kabarcıklarını çıkarın. Bu enjeksiyon için kateter. Enjeksiyondan önce 13-25 μm filtre ile %2,5 (w/v) floresan dektran 30 μL filtreleyin. Başka bir insülin şırındını 30 μL dektran aliquot ile doldurun ve doldurulmuş şırınna kabarcık olmadığından emin olun. 2. Kuyruk damarı enjeksiyonu Fareyi izofluran (%4 indüksiyon, %1,5 bakım) veya ketamin/ksilazin (60 mg/kg; 10 mg/kg; i.p.) ile uyuşturun ve göz yağlayıcı jel uygulayın. Görüntüleme sırasında daha kararlı kan akışı ölçümleri için ketamin/ksilazin önerilir ve doz 90 mg/kg’a çıkarılabilir; Daha uzun görüntüleme seansları için 10 mg/kg ketamin/ksilazin. Fare anestezinin cerrahi düzlemindeyken, yanal damarı genişletmek için kuyruğa ılık suyla dolu bir eldiven yerleştirin. Eldiveni 30 sn sonra çıkarın ve kuyruğu etanol ile temizleyin. Kuyruğu başparmak ve orta parmak arasına yerleştirin. Damarı genişletmek için kuyruk üzerindeki işaret parmağı ile basınç sağlayın. Diğer taraftan, kateterin iğnesini çerçeveyi tavana doğru yukarı doğru yönlendiren ön ayaklarla alın. Kuyruğu % 70 etanol ile temizledikten sonra, sorunsuz bir şekilde, iğneyi damara 0 ° açıyla yerleştirin ve iğnenin doğru yerleştirildiğinden emin olmak için kateterden salin enjekte edin.NOT: Pistonda direnç yoksa ve kuyrukta şişlik yoksa, iğne damardadır. Önemli bir direnç veya şişlik varsa, iğne çıkarılmalıdır. 2.2-2.5 adımları kuyruğun her iki tarafında 3 kat tekrarlanabilir ve yerleştirme doğru olana kadar her saniye kateterin ucundaki 30G iğnesi değiştirilebilir. İğne damara girdikten sonra kateterin ucundaki tuzlu şırıngayı floresan dektran içeren şırınga ile değiştirin (Adım 1.6). Dektranı yavaşça kateter tüpüne enjekte edin ve tüpe kabarcık girmemesini sağlayın. Bir hava kabarcığı belirginse, çıkarmak için kabarcık içeren boruyu kesin ve şırınnayı yeniden takın. Tüm dektran (30 μL aliquot) enjekte edildiğinde, şırınnayı çıkarın ve tuzlu şırınna ile değiştirin. Tüpte boya kalmayana kadar kalan dektranı borudan fareye enjekte edin. İğneyi kuyruktan çıkarın ve kanama durana kadar 10-30 sn gazlı bezle basınç sağlayın.KRİtİk: 6 denemeden sonra kuyruk damarı enjeksiyonu başarılı olmazsa, hayvan başka bir seansta görüntülenmelidir. Ayrıca, fareye enjekte edilen toplam hacim (salin ve dektran) 100 μL’yi geçmemelidir. 3. İki foton mikroskopisi Kranial pencereye odaklanmaNOT: Veri toplama sırasında izoflurana göre daha az damar etkisine (vazodilasyon) sahip olduğu için ketamin/ksilazine anestezi kullanın. Yukarıdaki adımlarda izofluran kullanıyorsanız, görüntülemeden önce fareye ketamin/ksilazine i.p. (yukarıda açıklanan önerilen doz) enjekte edin. Fareyi baş direğinden bir vida ile mikroskop altında bir ısıtma yastığı olan bir platforma sabitlayın. Farenin gözlerine göz yağı uygulayın. Kranial pencereyi nemli diş aplikatörleriyle temizleyin. Görüntüleme işlemini engelleyebilecek parçacık kalmadığından emin olun. Pencereye ultrason jeli uygulayın. Pial kan damarları pencerenin altında görülene kadar iki foton mikroskop hedefine odaklanın. Farenin nefes alışını kontrol edin ve ısıtma yastığının yeterli sıcaklık desteği sağladığından emin olun. Görüntü edinmeNOT: Bu deneyde kullanılan iki fotonlu mikroskop, numuneye ulaşan lazer miktarını kontrol eden bir Pockel hücresi ile floresan eksitasyon için ayarlanabilir bir Ti-Sapphire lazere sahiptir. Yayılan ışık, algılama için 595/50 bant geçiş filtresi (kırmızı) ve 525/70 bant geçiş filtresi (yeşil) ile iki GaAsP fotomultiplier tüpüne (PMT) 565 uzun geçiş dikrolik olarak bölünür.Adım 3.2 ila 3.4’te açıklanan yordamlar, bu protokoldeki iki foton mikroskobun belirli yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu). Bu adımlar diğer mikroskop yazılım ve ekipmanlarına uyarlanabilir. Oda ışıkları kapalıyken, 2-P Lazer kutusuna tıklayarak hem RCaMP’yi hem de floresan-dektranı heyecanlandırmak için mikroskop yazılımında istenen dalga boyunu 990 nm olarak ayarlayın. Güç/Kazanç kutusu/Lazerler bölümüne tıklayarak ve Pockels 1 hücre voltajını ‘da veya 1000 ölçeğinde 300 değerini ayarlayarak lazer gücünü ayarlayın. Bu ayarda örneğe ulaşan lazer gücünün daha önce ~30 mW olduğu belirlenmişti. Güç/Kazanç kutusu/ PMT’ler bölümüne tıklayarak ve değeri 700-800 olarak ayarlayarak PMT dedektörü hassasiyetini ayarlayın.NOT: Bu değerler floresan örneğinin yoğunluğuna göre ayarlanabilir ve odadaki ışıkları açmadan önce sıfıra ayarlanmalıdır. Görüntü Çözünürlüğü bölümüne gidin ve daha büyük bir görüntü boyutu için 512 x 512 çözünürlüğe tıklayın. 2-P Lazerdeklanşör açmak için 2-P Lazer /Aç’a tıklayın. Tarama Bölümü’ne gidin ve Canlı Tarama düğmesine tıklayın.NOT: Bu parametreler ve daha yüksek çözünürlükte canlı tarama, RCaMP pozitif duvar hücreleri ve floresan etiketli kan plazması görülebilir. Sinyal zayıfsa, tablo net olana kadar pockel değeri artırılabilir.KRİtİk: Yüzeysel doku katmanlarında, lazer gücü 50 mW’ı geçmemelidir, bu örnekteki Pockels hücreleri ayarlarında yaklaşık 600’dür. Duvar hücrelerinin ve vasküler ağın derinlik yığınını edinmeNOT: Vasküler ağdaki perisitleri düzgün bir şekilde bulmak için bir derinlik yığınının alınması önerilir. Ensheathing perisitleri, penetrasyonu arteriole 7,8,9’danbirinci ila dördüncü dallarda bulunur. Bu protokolde kullanılan mikroskop yazılımı derinlik yığınlarını “Z serisi” olarak ifade eder. Mikroskop hedefini X, Y ve Z düzleminde hareket ettirerek, RCaMP’nin düz kas hücresi etiketlemesi temel alınarak beynin yüzeyinde büyük bir arter lokalize edilir. Z Serisi kutusuna tıklayın. Pial damarların yakınındaki dokunun üst kısmına odaklanın, Geçerli Z serisi / Başlangıç konumu [μm] bölümüne tıklayarak bunu Z serisi yığınının sıfır noktası ve üst noktası olarak ayarlayın. Dört siyah çizgili ve üstte bir kırmızı çizgili kutuya tıklayın. Dokuda istediğiniz derinliğe odaklanın ve Geçerli Z serisi/Durdurma konumu [μm] bölümüne tıklayarak bunu yığının altı olarak ayarlayın. Dört siyah çizgili ve altta bir kırmızı çizgili kutuya tıklayın. “Adım Boyutu” düğmesinin altındaki kutuya istediğiniz değeri yazarak her görüntü düzleminin kalınlığını (adım boyutu) 1-2 μm olarak ayarlayın (Adım Boyutu düğmesi Z serisi/ Geçerli Z serisi bölümündeyerelleştirilmiştir). Bu, yığında alınan resim sayısını tanımlar. Lazer/PMT Telafisi kutusuna tıklayıp Göreli (Üstel Degrade)öğesini seçerek mikroskop yığında daha derine doğru ilerlerken lazer gücünü katlanarak artacak şekilde ayarlayın. Dosyayı adlandırın, kaydetmek için bir klasör seçtim ve Başlat Z serisi ‘nitıklatın. Satın aldıktan sonra, görüntüleme işleme yazılımında Z serisini açın. İki kanalı renkli görüntüler olarak birleştirin ve görüntü | kutusuna tıklayarak ilgi çekici perisitleri ve kan damarlarını arayan yığında tarama yapın Renk | Kanalları Böl; Resim | Renk | Kanalları Birleştir. Perisit içeren ilgi alanları (ROI’ler) seçeneğini belirleyin ve gelecekteki görüntüleme oturumlarında bu noktaların yeniden bulunmasına yardımcı olmak için konumları kaydedin. T serisi kalsiyum görüntüleme filmi kazanımı (zaman) Derinlik yığınını ve yukarıdan ROI’leri referans olarak kullanarak, canlı tarama modu sırasında X, Y ve Z eksenindeki mikroskop hedefini bir ilgi perisit bulunana kadar taşıyın. Perisit kalsiyum olaylarının bir filmini toplamak için Görüntü Çözünürlüğü bölümüne gidip 128×128 kutusuna tıklayarak edinme kare hızını (saniyede 10 kare >) artırın. T serisi kutusuna tıklayıp süre kutusuna süreyi girerek görüntüleme süresini 60 s olarak ayarlayın. Yolu Kaydet kutusunun yanında, kaydetme yolunu benzersiz bir dosya adıyla güncelleştirmek için üç noktalı düğmeye tıklayın. Daha düşük çözünürlüğü hesaba katmak ve Optik Yakınlaştırma [mag] bölümündeki değeri ayarlayarak perisitin daha yakından görünümünü elde etmek için gemiye optik olarak yakınlaştırın. Başlangıç T serisi ‘ne tıklayarak T serisini edin. Kimograflarla hemodinamik ölçümler (hat taramaları) Canlı Tarama modunda 512 x 512piksel çözünürlükte ilgi çekici gemiye odaklanın. Kan damarı çapını ve kırmızı kan hücresi hızını ölçmek için, mikroskopla tek boyutlu tarama başlatmak için Hat Taraması’nı tıklayın. Tarama süresini (30-60 s) milisaniye olarak ayarlayın. İlgi çekici damarı ikiye bölen ve gemi boyunca paralel hareket eden bir çizgi çizin. Bu, soldaki damar çapının ve sağdaki damardan hareket eden kırmızı kan hücrelerinin çizgilerinin bir kimografını oluşturacaktır.NOT: Birden fazla kan damarı aynı görüntüleme düzleminde olduğu sürece aynı çizgi ile ölçülebilir. Dosyayı adlandırın ve verileri almak için Başlangıç Satırlarını tıklatın. 4. Görüntü Analizi Kalsiyum film analizi.NOT: Bu protokol spektral karıştırma adımlarını özetler (Şekil 2) ve elle seçilmiş ROI’leri kullanarak ensheathing perisit kalsiyum olaylarını analiz etmek için iki farklı yöntem (Şekil 3) ve otomatik, etkinlik tabanlı yatırım getirisi seçimi (Şekil 4)16,17. Her yatırım getirisinden normalleştirilmiş kalsiyum izi ile sinyal zirvelerini tespit etmek ve sınıflandırmak için, veriler genlik ve genişlik tahminleri için verileri yumuşatmaya ve ayrıca farklı şekillerdeki zirveleri tanımlamaya yardımcı olan uzun geçişli ve bant geçişli filtrelenir: tek tepeler, çok tepeler ve platolar (Şekil 3B). Bu analizin parametreleri, farklı dinamik hücresel sinyal türlerini tespit etmek için optimize edilebilir. Aşağıdaki adımlar, yukarıda belirtildiği gibi kalsiyum filmlerini analiz etmek için farklı kodlar içeren görüntü işleme paketleri ile görüntü işleme yazılımının ve programlama yazılımının kullanılmasını gerektirecektir. Bu protokolde kullanılan programların ve paketlerin tam listesi için lütfen malzeme tablosuna bakın. Farklı mikroskop türlerinden görüntüleme verileri, görüntülerdeki meta verileri koruyan bu paketlerle içe aktarılabilir.NOT: Adım 4.1.1-4.1.7, manuel kalsiyum analiz yönteminde daha sonra kullanılmak üzere görüntü işleme yazılımında elle ROI’lerin nasıl seçileceği açıklar (Adım 4.1.16).xml dosyasını yazılım araç çubuğuna sürükleyerek kalsiyum görüntüleme T serisini görüntü işleme yazılımına yükleyin. Tamam kutusuna tıklayın. Yığının ortalamasını alın (yığının ortalaması görüntü işleme yazılımı tarafından “Z projeksiyonu” olarak etiketlenir). Bu, Resim | tıklayarak yapılabilir Yığınlar | Takım çubuğunda Z projeksiyonu. Adım 3.3.9’da olduğu gibi her iki kanaldan da renkli bir görüntü yapın. Çözümle | kutusunu tıklatarak yatırım getirisi yöneticisi penceresini açın Araçlar | Yatırım Getiri Yöneticisiveya klavyedeki “T” harfine basmanız yeterlidir. Görüntü işleme yazılımı araç çubuğundaki çokgen şekline tıklayarak çokgen aracını seçin ve soma ve işlemler gibi görünür ensheathing perisit yapılarını özetleyin. Seçili ROI’leri yatırım getirisi yöneticisine eklemek için YATıRıM GETIRI’si yöneticisi penceresinde bulunan Ekle düğmesini tıklatın. Yeniden Adlandır düğmesini tıklatarak her ilgi alanına benzersiz bir ad verin ve Daha Fazla’yı tıklatarak daha sonra programlama yazılımına yüklenebilen bir zip klasörü olarak kaydedin>> | ‘yi kaydedin.NOT: Adım 4.1.8-4.1.14, kalsiyum T serisinin programlama platformuna nasıl aktarılacağını ve mikroskop PMT’leri tarafından tespit edilen farklı floroforların farklı kanallara nasıl karıştırıldığını açıklar (Şekil 2). Programlama yazılımını açın ve görüntü işleme paketlerinin klasörlerinin yolda olduğundan emin olun (bkz. Malzeme Tablosu). Dosya seçim penceresini otomatik olarak açan programlama platformu komut penceresinde bioformats işlevini çağırarak kalsiyum T serisini programlama yazılımına içe aktarın. İstediğiniz numarayı girerek her kanalda ne olduğunu tanımlayın. Bu örnek verilerde Kanal 1 yanıtı=6 (cellular_signal), Kanal 2 yanıtı=1 (blood_plasma). Çizim işlevini çağırarak görselleştirmeyi kolaylaştırmak için verileri programlama yazılımı içinde bir film olarak çizin. Kırmızı RCaMP kanalına kanayan floresan-dektrandan yeşil floresan çıkarmak için, programlama platformu komut penceresindeki unmix_chs işlevini çağırarak görüntü işleme paketindeki kanalları açın. Kanal 1’deki bu florofordan yalnızca floresan içeren bir bölge seçin (örneğin, bu durumda RCaMP). Bu örnekte kan plazmasındaki floresan gibi florofor 2’den yalnızca floresan içeren bir bölge seçin. Her iki florofordan floresan olmayan bir arka plan alanı seçin. Bu, her kanaldaki her piksele uygulanan bir spektral katkı matrisi oluşturur. Bu yapılarda kalsiyum olaylarının tespitini artıracak RCaMP sinyalinin lokalizasyonunu önemli ölçüde geliştirir.NOT: Yukarıda belirtildiği gibi, kalsiyum görüntüleme verilerinin görüntü işleme paketleri içinde analiz edilebilmesinin birden fazla yolu vardır. Adım 4.1.16-4.1.23, elle seçilmiş CE’leri kullanarak ensheathing perisit kalsiyum olaylarını analiz etme yöntemini açıklar. Programlama platformu komut penceresinde CellScan işlevini çağırarak, karıştırılmamış kalsiyum filminde hücresel sinyal analizini çalıştırın. Kodda “Hangi yatırım getirisi algılama yöntemini kullanmak istersiniz?” sorulur. Elle seçilen ROI’leri programlama platformuna yüklemek için 2 sayısını yazın. İlgi çekici bölgeleri perisitlerden seçilen zip klasöründen daha önce elle yükleyin (Adım 4.1.6). Kodda “Ölçek faktörü nedir?” sorulur. Analiz edilen görüntü serisine göre elle seçilen ROI’ler için ölçek faktörünü belirleyin ve ölçeğin sayısını yazın. Bu örnekte, orijinal kalsiyum filmiyle aynı çözünürlükte, 128×128 pikselli görüntülerde seçildiklerinden ROI’lerin yeniden boyutlandırılması gerekmediğinden ölçek faktörü 1’dir. Komut penceresindeki işlem ve çizim işlevlerini çağırarak her yatırım getirisinin çizimlerini ve normalleştirilmiş kalsiyum izlerini farklı renklerde (Şekil 3A) oluşturun. Kod, tek tek izlemelerdeki kalsiyum olaylarının çoğunu algılamazsa, opt_config işlevini çağırarak ve kısa geçiş filtrelenmiş verilerin eşiğini T serisinin ilk 30 karesi olan temel dönemin standart sapmasının üç katına düşürme gibi değerleri ayarlayarak yapılandırma iyileştirme kutusundaki yerleşik parametreleri değiştirin. Yeni parametreleri uygulamak için en iyi duruma getirme kutusundaki İşlem düğmesini seçin.NOT: Sinyalleri tespit etmek ve sınıflandırmak için, normalleştirilmiş kalsiyum izi uzun geçişli ve bant geçişi filtrelenmiştir, bu da genlik ve genişlik tahminleri için verileri yumuşatmaya yardımcı olur, aynı zamanda sinyallerin tek tepeler, çok tepeli veya plato olup olmadığını belirlemeye yardımcı olur (Şekil 3B). Verileri, ilgi alanları ve komut penceresindeki output_data işlevi çağrılarak tanımlanan tepeler hakkında uzamsal bilgiler içeren bir .csv dosyası olarak çıktısını verin. Bir istatistik programında daha fazla analiz için dosyaya benzersiz bir ad verin.NOT: Adım 4.1.24-4.1.31, aktivite tabanlı ROI’lerin analizini kullanarak ensheathing perisit kalsiyum olaylarını analiz etme yöntemini açıklar. Kalsiyum filmini içe aktarmak, kanalları karıştırmak ve programlama platformundaki CellScan işlevini çağırmak için 4.1.8.-4.1.16 adımlarını yineleyin. Kodda “Hangi yatırım getirisi algılama yöntemini kullanmak istersiniz?” sorulur. Faaliyete göre otomatik faiz tanımlama bölgesini seçmek ve floresandaki değişimi 3 boyutta (x, y ve zaman) seçmek için 6 sayısını yazın; “3D FLIKA algoritması”). Komut penceresindeki işlem ve çizim işlevlerini çağırarak, tanımlanan ilgi alanlarını farklı renkler olarak görüntülemek için işlenen sonuçları çizin. Her yatırım getirisi zaman ve mekanda ayırt edilir ve yer paylaşımı maskesi olarak temsil edilir (Şekil 4). Algoritma gözle açıkça görülebilen ROI’leri algılamazsa, opt_config işlevini çağırarak ve verileri zamanında (2 sn) yumuşatan gauss filtresini artırmak ve ROI bulma eşiğini taban çizgisinin standart sapmasının 3 katına çıkarmak gibi değerleri ayarlayarak iyileştirme kutusundaki yerleşik parametreleri değiştirin. Yeni parametreleri uygulamak için en iyi duruma getirme kutusundaki işlem düğmesini seçin. Optimizasyon işlemi ile daha fazla ROI tanımlanmalıdır (Şekil 4B). Daha fazla görselleştirme için varsayılan kutunun modunu optimizasyon penceresinde filme değiştirerek etkinlik alanlarını (gökkuşağı renkleriyle özetlenmiş) net bir şekilde tanımlamak için ROI’leri bir film olarak çizin. Komut penceresinde output_data işlevini çağırarak verileri csv dosyası olarak çıktısını verin. Bu dosya bir istatistik programında daha fazla analiz edilebilir.NOT: Analiz parametreleri her türlü dinamik hücresel sinyale (kalsiyum, FRET oranları vb.) uyacak şekilde ayarlanabilir. Yukarıdaki tüm adımlar, birçok kalsiyum filmini aynı ayarlarla toplu olarak işlemek için basit programlama kodu ile otomatiklenebilir. Hat taraması kan akışı analizi. Bölüm 3.5’te alınan hat tarama kimograf veri dosyasını programlama yazılımına alın. Kodda “Kanal 1 ve 2’de neler gösteriliyor?” sorulur. İstendiğinde her kanalda ne olduğunu tanımlayın. Bu örnekte, Kanal 1 boştur (0yazın) ve Kanal 2 blood_plasma (1yazın). Kimografideki çapa karşılık gelen alanı seçmek için bir kutu açan LineScanDiam işlevini çağırarak hat taramasında çap analizi işlevini çalıştırın (Şekil 5B, sol). Kimograf floresan sınırlarının dışına damar çapına karşılık gelen bir kutu çizin. Gemi çapı için tam genişliği yarı maksima cinsinden ölçmek ve çizim işleviyle bir çizim (Şekil 5C) oluşturmak için işlem işlevini çağırarak bu veri sınıfını işleyin. Komut penceresinde output_data işlevini çağırarak verileri csv dosyası olarak çıktısını verin. Bu dosya bir istatistik programında daha fazla analiz edilebilir. Kimografideki RBC hızına karşılık gelen alanı seçmek için bir kutu açan LineScanVel işlevini çağırarak hız radon dönüşüm analizini çalıştırın (Şekil 5B, sağ). Kimograf floresanının sınırına damar hızına karşılık gelen bir kutu çizin. Floresandaki çizgilerin açısından kırmızı kan hücrelerinin hızını, akısını ve doğrusal yoğunluğunu hesaplamak için işlem işlevini çağırarak bu veri sınıfını işleyin. Çizim işleviyle bir çizim (Şekil 5D) oluşturun. Komut penceresinde output_data işlevini çağırarak verileri csv dosyası olarak çıktısını verin. Bu dosya bir istatistik programında daha fazla analiz edilebilir.NOT: Kimografların çap ve hız analizinin doğru olabilmesi için siyah boşluklar arasında iyi tanımlanmış kenarlara sahip berrak floresan olması gerekir (Şekil 5A, B). Ortogonal ve paralel çizgilerin kesin bir şekilde çizilmesi çok önemlidir, aksi takdirde kimografların güvenilir analizi mümkün olmayacaktır. Görüntü işleme algoritmaları ile kalsiyum analizine benzer şekilde, çap ve hız hesaplama parametreleri optimize edilebilir.