Calcio de pericitos cerebrales e imágenes hemodinámicas en ratones transgénicos in vivo

Todos los procedimientos que involucran animales de experimentación que se describen a continuación han sido aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Manitoba, que se rige por el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. 1. Configuración y preparación del procedimiento NOTA: Se requieren los siguientes elementos para una inyección de catéter de vena de cola: jeringas de insulina, una pieza de tubo de PE10 de 15 cm, agujas de 30 G, gasa, solución salina, fórceps, tinte dextrano de fluoresceína verde, alicates y tijeras. Además, tenga una aguja lista con anestesia con ketamina / xilazina que se inyectará antes de la sesión de imágenes. CRÍTICO: Todos los materiales y equipos en los Pasos 1 y 2 deben ser esterilizados antes del uso mediante autoclave o enjuague con etanol al 70%. Si los alicates no se pueden esterilizar adecuadamente, se recomienda el uso de un par de portaagujas grandes. El montaje del catéter debe hacerse con alicates y pórceps para evitar punciones accidentales con aguja. Corte aproximadamente 15-20 cm de tubos de polietileno, PE10 (I.D. 28 mm; D.O. 61 mm). Llene una jeringa de insulina de 27 G con solución salina al 0,9% y ate la aguja de la jeringa en la punta del tubo de polietileno. Empuje la solución salina a través del tubo, asegurándose de que no haya fugas. Con alicates, doble una aguja de 30 G (0,3 mm x 25 mm) hacia adelante y hacia atrás hasta que se rompa del cubo. La aguja debe estar limpia sin curvas. Sosteniendo la aguja con forzadores, inserte cuidadosamente la aguja en el extremo del tubo de PE10 que está conectado a la jeringa llena de solución salina y retire las burbujas de aire. Este es el catéter para inyección. Filtrar 30 μL de 2,5% (p/v) de fluoresceína dextrano a través de un filtro de 13-25 μm antes de la inyección. Llene otra jeringa de insulina con la alícuota de 30 μL de dextrano y asegúrese de que no haya burbujas en la jeringa llena. 2. Inyección de la vena de la cola Anestesiar al ratón con isoflurano (4% de inducción, 1,5% de mantenimiento) o ketamina/xilazina (60 mg/kg; 10 mg/kg; p.i.) y aplicar gel lubricante para los ojos. La ketamina/xilazina se recomienda para mediciones de flujo sanguíneo más estables durante las imágenes y la dosis se puede aumentar a 90 mg/kg; 10 mg/kg de ketamina/xilazina para sesiones de diagnóstico por imágenes más largas. Cuando el ratón esté en el plano quirúrgico de la anestesia, coloque un guante lleno de agua tibia en la cola para dilatar la vena lateral. Retire el guante después de 30 s y limpie la cola con etanol. Coloque la cola entre el pulgar y el dedo medio. Proporcionar presión con el dedo índice en la cola para dilatar la vena. Con la otra mano, recoge la aguja del catéter con las pórceps orientando el bisel hacia arriba hacia el techo. Después de limpiar la cola con etanol al 70%, inserte suavemente la aguja en la vena en un ángulo de 0 ° e inyecte suavemente solución salina a través del catéter para asegurarse de que la aguja se coloque correctamente.NOTA: Si no hay resistencia en el émbolo y no hay hinchazón de la cola, entonces la aguja está en la vena. Si hay resistencia o hinchazón significativas, se debe retirar la aguja. Los pasos 2.2-2.5 se pueden repetir hasta 3 veces a cada lado de la cola, reemplazando la aguja 30G al final del catéter cada segundo ensayo hasta que la colocación sea correcta. Una vez que la aguja esté en la vena, cambie la jeringa salina al final del catéter con la jeringa que contiene fluoresceína dextrano (Paso 1.6). Inyecte lentamente el dextrano en el tubo del catéter, asegurándose de que no entren burbujas en el tubo. Si hay una burbuja de aire aparente, corte el tubo que contiene la burbuja para retirarla y vuelva a colocar la jeringa. Cuando se haya inyectado todo el dextrano (alícuota de 30 μL), retire la jeringa y reemplácela con la jeringa salina. Inyecte el dextrano restante del tubo en el ratón hasta que no quede ningún tinte en el tubo. Retire la aguja de la cola y proporcione presión con una gasa durante 10-30 s hasta que el sangrado se detenga.CRÍTICA: Si después de 6 intentos la inyección de la vena de la cola no tiene éxito, el animal debe ser fotografiado en otra sesión. Además, el volumen total (solución salina y dextrano) inyectado en el ratón no debe exceder los 100 μL. 3. Microscopía de dos fotones Centrarse en la ventana cranealNOTA: Use anestesia con ketamina/xilazina durante la adquisición de datos porque tiene menos efectos vasculares (vasodilatación) que el isoflurano. Si usa isoflurano en los pasos anteriores, inyecte al ratón ketamina/xilazina i.p. (dosis recomendada descrita anteriormente) antes de la obtención de imágenes. Fije el ratón con un tornillo a través de su poste de la cabeza a una plataforma con una almohadilla térmica bajo el microscopio. Aplique lubricante para los ojos en los ojos del ratón. Limpie la ventana craneal con aplicadores dentales húmedos. Asegúrese de que no queden partículas que puedan interferir con el proceso de obtención de imágenes. Aplique gel de ultrasonido en la ventana. Enfoque a través del objetivo del microscopio de dos fotones hasta que los vasos sanguíneos piales se puedan ver debajo de la ventana. Compruebe la respiración del ratón y asegúrese de que la almohadilla térmica proporciona suficiente soporte de temperatura. Adquisición de imágenesNOTA: El microscopio de dos fotones utilizado en este experimento tiene un láser Ti-Sapphire sintonizable para la excitación de fluorescencia con una célula Pockel que controla la cantidad de láser que llega a la muestra. La luz emitida se divide por un dicroico de paso largo de 565 a dos tubos fotomultiplicadores GaAsP (PMT) con filtro de paso de banda 595/50 (rojo) y filtro de paso de banda 525/70 (verde) para la detección.Los procedimientos descritos en los pasos 3.2 a 3.4 se realizan utilizando un software específico del microscopio de dos fotones de este protocolo (ver Tabla de Materiales). Estos pasos se pueden adaptar a otro software y equipo de microscopio. Con las luces de la habitación apagadas, ajuste la longitud de onda deseada en el software del microscopio a 990 nm para excitar tanto RCaMP como fluoresceína-dextrano haciendo clic en el cuadro láser 2-P. Ajuste la potencia del láser haciendo clic en la sección Power/Gain box/Lasers y ajustando el voltaje de la celda Pockels 1 al 30% o un valor de 300 en una escala de 1000. La potencia del láser que llega a la muestra en esta configuración se determinó previamente que era de ~ 30 mW. Configure la sensibilidad del detector PMT haciendo clic en la sección Power/Gain box/PMTs y ajustando el valor a 700-800.NOTA: Estos valores se pueden ajustar en relación con la intensidad de la muestra fluorescente y deben establecerse en cero antes de encender las luces de la habitación. Vaya a la sección Resolución de imagen y haga clic en la resolución de 512 x 512 para obtener un tamaño de imagen más grande. Haga clic en Láser 2-P/Abrir para abrir el obturador láser 2-P. Vaya a la sección Escaneo y haga clic en el botón Escaneo en vivo.NOTA: Se puede ver el escaneo en vivo con estos parámetros y una resolución más alta, las células murales RCaMP positivas y el plasma sanguíneo etiquetado fluorescentemente. Si la señal es débil, el valor de pockel se puede aumentar hasta que la imagen sea clara.CRÍTICO: En las capas de tejido superficial, la potencia del láser no debe exceder los 50 mW, que es aproximadamente 600 en la configuración de las células de Pockels en este ejemplo. Adquirir una pila de profundidad de las células murales y la red vascularNOTA: Se recomienda la adquisición de una pila de profundidad para localizar adecuadamente los pericitos en la red vascular. Los pericitos de envainamiento se encuentran en la primera a cuarta ramas de la arteriola penetrante7,8,9. El software de microscopio utilizado en este protocolo se refiere a las pilas de profundidad como “serie Z”. Moviendo el objetivo del microscopio en los planos X, Y y Z, localizar una arteria grande en la superficie del cerebro en función del etiquetado de células musculares lisas de RCaMP. Haga clic en el cuadro Z-Series. Concéntrese en la parte superior del tejido cerca de los vasos piales, establezca esto como el punto cero y la parte superior de la pila de la serie Z haciendo clic en la sección Actual de la serie Z / Posición de inicio [μm]. Haga clic en el cuadro con cuatro rayas negras y una franja roja en la parte superior. Concéntrese hacia abajo en el tejido a la profundidad deseada y configúre esto como la parte inferior de la pila haciendo clic en la sección Actual de la serie Z / Posición de parada [μm]. Haga clic en el cuadro con cuatro rayas negras y una franja roja en la parte inferior. Establezca el grosor de cada plano de imagen (tamaño de paso) en 1-2 μm escribiendo el valor deseado en el cuadro debajo del botón ” Tamaño depaso” (el botónTamaño de paso está localizado en la sección serie Z/Serie Z actual). Esto definirá el número de imágenes que se adquieren en la pila. Configure la potencia del láser para que aumente exponencialmente a medida que el microscopio se mueve más profundamente a través de la pila haciendo clic en el cuadro Compensación láser / PMT y seleccionando Relativo (gradiente exponencial). Asigne un nombre al archivo, elija una carpeta para guardarlo y haga clic en Iniciar Z-series. Después de la adquisición, abra la serie Z en el software de procesamiento de imágenes. Fusione los dos canales como imágenes coloreadas y escanee a través de la pila en busca de pericitos y vasos sanguíneos de interés haciendo clic en el cuadro Imagen | | de color Canales divididos; Imagen | | de color Combinar canales. Seleccione regiones de interés (ROI) que contengan pericitos y guarde las posiciones para ayudar a localizar estos puntos nuevamente en futuras sesiones de imágenes. Adquisición de películas de imágenes de calcio de la serie T (tiempo) Usando la pila de profundidad y los ROI desde arriba como referencia, mueva el objetivo del microscopio en los ejes X, Y y Z durante el modo de escaneo en vivo hasta que se encuentre un pericito de interés. Para recopilar una película de eventos de calcio pericito, aumente la velocidad de fotogramas de adquisición (>10 fotogramas por segundo) yendo a la sección Resolución de imagen y haciendo clic en el cuadro 128×128. Establezca la duración de la imagen en 60 s haciendo clic en el cuadro de la serie T e ingresando el tiempo en el cuadro de duración. Junto al cuadro Guardar ruta, haga clic en el botón con tres puntos para actualizar la ruta de guardado con un nombre de archivo único. Zoom óptico en el recipiente para tener en cuenta la resolución más baja y obtener una vista más cercana del pericito ajustando el valor en la sección Zoom óptico [mag]. Adquiera la serie T haciendo clic en Iniciar la serie T. Mediciones hemodinámicas con kymographs (escaneos de línea) Concéntrese en el recipiente de interés a una resolución de 512 x 512píxeles en el modo Live Scan. Para medir el diámetro de los vasos sanguíneos y la velocidad de los glóbulos rojos, haga clic en el Escaneo de línea para iniciar un escaneo unidimensional con el microscopio. Establezca la duración del escaneo (30-60 s) en milisegundos. Dibuje una línea que divida el recipiente de interés y se mueva paralelo a lo largo del recipiente. Esto generará un kymograph del diámetro del vaso a la izquierda y rayas de los glóbulos rojos que se mueven a través del vaso a la derecha.NOTA: Se pueden medir varios vasos sanguíneos con la misma línea, siempre y cuando estén en el mismo plano de imagen. Asigne un nombre al archivo y haga clic en las líneas de inicio para adquirir los datos. 4. Análisis de imágenes Análisis de películas de calcio.NOTA: Este protocolo describe los pasos para la desmezcla espectral (Figura 2) y dos métodos diferentes para analizar los eventos de calcio de pericitos que envuelven utilizando ROI manuales seleccionados a mano (Figura 3) y la selección automatizada del ROI basada en actividades (Figura 4)16,17. Para detectar y clasificar los picos de señal con la traza de calcio normalizada de cada ROI, los datos se filtran de paso largo y paso de banda, lo que ayuda a suavizar los datos para las estimaciones de amplitud y anchura y también a identificar picos de diferentes formas: picos individuales, picos múltiples y mesetas (Figura 3B). Los parámetros para este análisis se pueden optimizar para detectar diferentes tipos de señales celulares dinámicas. Los pasos a continuación requerirán el uso de software de procesamiento de imágenes y software de programación con paquetes de procesamiento de imágenes que contienen diferentes códigos para analizar películas de calcio como se mencionó anteriormente. Consulte la tabla de materiales para obtener una lista completa de los programas y paquetes utilizados en este protocolo. Los datos de imágenes de diferentes tipos de microscopios se pueden importar con estos paquetes manteniendo los metadatos de las imágenes.NOTA: Los pasos 4.1.1-4.1.7 describen cómo seleccionar el ROI a mano en el software de procesamiento de imágenes para su posterior uso en el método de análisis manual de calcio (Paso 4.1.16)Cargue la serie T de imágenes de calcio en el software de procesamiento de imágenes, arrastrando el archivo de .xml a la barra de herramientas del software. Haga clic en el cuadro Aceptar. Tome el promedio de la pila (el promedio de la pila está etiquetado como “proyección Z” por el software de procesamiento de imágenes). Esto se puede hacer haciendo clic en imagen | Pilas | Proyección Z en la barra de herramientas. Haga una imagen coloreada desde ambos canales como en el paso 3.3.9. Abra la ventana del administrador de ROI haciendo clic en el cuadro Analizar | Herramientas | ROI Manager,o simplemente pulsando la letra”T”en el teclado. Seleccione la herramienta de polígono haciendo clic en la forma del polígono en la barra de herramientas del software de procesamiento de imágenes y delinee las estructuras de pericitos de envainamiento visibles, como el soma y los procesos. Haga clic en el botón Agregar ubicado en la ventana del administrador de ROI para agregar ROI seleccionados en el administrador de ROI. Asigne a cada región de interés un nombre único haciendo clic en el botón Cambiar nombre y guárdelos como una carpeta zip que se puede cargar más adelante en el software de programación haciendo clic en Más>> | Guardar.NOTA: Los pasos 4.1.8-4.1.14 describen cómo importar la serie T de calcio a la plataforma de programación y cómo desmezclar los diferentes fluoróforos detectados por los PMT del microscopio en diferentes canales(Figura 2). Abra el software de programación y asegúrese de que las carpetas de los paquetes de procesamiento de imágenes estén en la ruta (consulte tabla de materiales). Importe la serie T de calcio en el software de programación llamando a la función BioFormats en la ventana de comandos de la plataforma de programación, que abre automáticamente la ventana de selección de archivos. Defina lo que hay en cada canal ingresando el número deseado. En estos datos de ejemplo, Channel 1 answer=6 (cellular_signal), Channel 2 answer=1 (blood_plasma). Traza los datos como una película dentro del software de programación para facilitar la visualización llamando a la función de trama. Para eliminar la fluorescencia verde de la fluoresceína-dextrano que sangra en el canal RCaMP rojo, desmezcla los canales en el paquete de procesamiento de imágenes llamando a la función unmix_chs en la ventana de comandos de la plataforma de programación. Seleccione una región que solo contenga fluorescencia de este fluoróforo en el canal 1, como RCaMP en este caso. Seleccione una región que solo contenga fluorescencia del fluoróforo 2, como la fluoresceína en el plasma sanguíneo en este ejemplo. Seleccione un área de fondo que no tenga fluorescencia de ninguno de los fluoróforos. Esto genera una matriz de contribución espectral que se aplica a cada píxel en cada canal. Mejora significativamente la localización de la señal RCaMP, lo que mejorará la detección de eventos de calcio en estas estructuras.NOTA: Como se mencionó anteriormente, hay varias formas en que los datos de imágenes de calcio se pueden analizar dentro de los paquetes de procesamiento de imágenes. Los pasos 4.1.16-4.1.23 describen el método para analizar los eventos de calcio de pericitos que envuelven utilizando ROI manuales seleccionados a mano. Ejecute el análisis de señalización celular en la película de calcio sin mezclar llamando a la función CellScan en la ventana de comandos de la plataforma de programación. El código preguntará “¿Qué método de detección de ROI le gustaría usar?”. Escriba el número 2 para cargar los ROI seleccionados a mano en la plataforma de programación. Cargue las regiones de interés de la carpeta zip que se seleccionaron de los pericitos a mano anteriormente (Paso 4.1.6). El código preguntará “¿Cuál es el factor de escala?”. Determine el factor de escala para los ROI seleccionados a mano en relación con la serie de imágenes que se está analizando y escriba el número de la escala. En este ejemplo, el factor de escala es 1 porque no es necesario cambiar el tamaño de los ROI, ya que se seleccionaron en imágenes con 128×128 píxeles, la misma resolución que la película de calcio original. Genere gráficos de cada ROI y los rastros de calcio normalizados en diferentes colores(Figura 3A)llamando a las funciones de proceso y trazado en la ventana de comandos. Si el código no detecta la mayoría de los eventos de calcio en los seguimientos individuales, modifique los parámetros integrados dentro del cuadro de optimización de la configuración llamando a la función opt_config y ajustando los valores, como disminuir el umbral para los datos filtrados de paso corto a tres veces la desviación estándar del período de referencia, que son los primeros 30 fotogramas de la serie T. Seleccione el botón Procesar en el cuadro de optimización para aplicar los nuevos parámetros.NOTA: Para detectar y clasificar las señales, la traza de calcio normalizada es de paso largo y paso de banda filtrada, lo que ayuda a suavizar los datos para las estimaciones de amplitud y anchura, pero también para determinar si las señales son picos individuales, picos múltiples o mesetas(Figura 3B). Genere los datos como un archivo .csv que contiene información espacial sobre las regiones de interés y los picos que se identificaron llamando a la función output_data en la ventana de comandos. Asigne al archivo un nombre único para su posterior análisis en un programa de estadísticas.NOTA: Los pasos 4.1.24-4.1.31 describen el método para analizar los eventos de calcio pericito de envainamiento mediante el análisis de ROI basados en la actividad. Repita los pasos 4.1.8.-4.1.16 para importar la película de calcio, desmezclar los canales y llamar a la función CellScan en la plataforma de programación. El código preguntará “¿Qué método de detección de ROI le gustaría usar?”. Escriba el número 6 para seleccionar la identificación automatizada de la región de interés en función de la actividad y el cambio en la fluorescencia en 3 dimensiones (x, y y tiempo; “Algoritmo FLIKA 3D”). Trace los resultados procesados para ver las regiones de interés identificadas como diferentes colores llamando a las funciones de proceso y trazado en la ventana de comandos. Cada ROI se distingue en tiempo y espacio y se representa como una máscara sobreabreada (Figura 4). Si el algoritmo no detecta ROI que son claramente visibles a simple vista, modifique los parámetros incorporados dentro del cuadro de optimización llamando a la función opt_config y ajustando los valores, como aumentar el filtro gaussiano que suaviza los datos en el tiempo (en 2 s) y disminuir el umbral para encontrar ROI a 3 veces la desviación estándar de la línea de base. Seleccione el botón de proceso en el cuadro de optimización para aplicar los nuevos parámetros. Con el proceso de optimización se deben identificar más ROI(Figura 4B). Traza los ROI como una película para identificar claramente las áreas de actividad (delineadas en colores del arco iris) cambiando el modo del cuadro predeterminado a película dentro de la ventana de optimización para una mayor visualización. Genere los datos como un archivo csv llamando a la función output_data en la ventana de comandos. Este archivo se puede analizar más a fondo en un programa de estadísticas.NOTA: Los parámetros de análisis se pueden ajustar para adaptarse a cualquier tipo de señal celular dinámica (calcio, relaciones FRET, etc.). Todos los pasos anteriores se pueden automatizar con un código de programación simple para procesar por lotes muchas películas de calcio con la misma configuración. Análisis de flujo sanguíneo de exploración de línea. Importe el archivo de datos kymograph de escaneo de línea adquirido en la sección 3.5 en el software de programación. El código preguntará “¿Qué se muestra en los canales 1 y 2?”. Defina lo que hay en cada canal cuando se le solicite. En este ejemplo, el canal 1 está en blanco (tipo 0)y el canal 2 está blood_plasma (tipo 1). Ejecute la función de análisis de diámetro en el escaneo de línea llamando a la función LineScanDiam, que abre un cuadro para seleccionar el área que corresponde al diámetro en el kymograph(Figura 5B,izquierda). Dibuje una caja fuera de los límites de fluorescencia del kymograph que corresponda al diámetro del vaso. Procese esta clase de datos llamando a la función de proceso para medir el ancho total a la mitad de los máximos para el diámetro del recipiente y genere una gráfica (Figura 5C) con la función de gráfica. Genere los datos como un archivo csv llamando a la función output_data en la ventana de comandos. Este archivo se puede analizar más a fondo en un programa de estadísticas. Ejecute el análisis de transformación de radón de velocidad llamando a la función LineScanVel, que abre un cuadro para seleccionar el área que corresponde a la velocidad de RBC en el kymograph(Figura 5B,derecha). Dibuje una caja dentro del borde de la fluorescencia del kymograph que corresponda a la velocidad del vaso. Procese esta clase de datos llamando a la función de proceso para calcular la velocidad, el flujo y la densidad lineal de los glóbulos rojos desde el ángulo de las rayas en la fluorescencia. Genere una gráfica (Figura 5D) con la función de gráfica. Genere los datos como un archivo csv llamando a la función output_data en la ventana de comandos. Este archivo se puede analizar más a fondo en un programa de estadísticas.NOTA: Los kymographs deben tener fluorescencia clara con aristas bien definidas entre los espacios negros para que el análisis de diámetro y velocidad sea preciso(Figura 5A,B). Es muy importante dibujar las líneas ortogonales y paralelas de manera precisa, de lo contrario no será posible un análisis confiable de los kymographs. Al igual que el análisis de calcio con los algoritmos de procesamiento de imágenes, se pueden optimizar los parámetros para los cálculos de diámetro y velocidad.