Gehirn Perizyten-Kalzium und hämodynamische Bildgebung bei transgenen Mäusen in Vivo

Alle unten beschriebenen Verfahren mit Versuchstieren wurden vom Animal Care Committee der University of Manitoba genehmigt, das vom Canadian Council on Animal Care geregelt wird. 1. Aufbau und Vorbereitung des Verfahrens HINWEIS: Für eine Schwanzvenenkatheterinjektion sind folgende Gegenstände erforderlich: Insulinspritzen, ein 15 cm Stück PE10-Schlauch, 30 G-Nadeln, Gaze, Kochsalzlösung, Zange, grünes Fluoreszein-Dextran-Farbstoff, Zange und Schere. Halten Sie auch eine Nadel mit Ketamin / Xylazin-Anästhesie bereit, die vor der Bildgebungssitzung injiziert wird. KRITISCH: Alle Materialien und Geräte in den Schritten 1 und 2 müssen vor der Verwendung durch Autoklavieren oder Spülen mit 70% Ethanol sterilisiert werden. Wenn die Zange nicht richtig sterilisiert werden kann, wird die Verwendung eines Paares großer Nadelhalter empfohlen. Die Kathetermontage muss mit Zange und Zange erfolgen, um versehentliche Nadelstiche zu vermeiden. Schneiden Sie ca. 15-20 cm Polyethylenschlauch, PE10 (I.D. 28 mm; O.D. 61 mm). Füllen Sie eine 27 G Insulinspritze mit 0,9% Kochsalzlösung und schnüren Sie die Nadel der Spritze in die Spitze des Polyethylenröhrchens. Drücken Sie Kochsalzlösung durch das Rohr und stellen Sie sicher, dass keine Lecks vorhanden sind. Biegen Sie mit einer Zange eine 30 G-Nadel (0,3 mm x 25 mm) hin und her, bis sie von der Nabe bricht. Die Nadel muss sauber und ohne Biegungen sein. Halten Sie die Nadel mit einer Zette, führen Sie die Nadel vorsichtig in das Ende des PE10-Schlauchs ein, der an der mit Kochsalzlösung gefüllten Spritze befestigt ist, und entfernen Sie Luftblasen. Dies ist der Katheter für die Injektion. Filtern Sie 30 μL 2,5% (w/v) Fluorescein-Dextran vor der Injektion durch einen 13-25 μm Filter. Füllen Sie eine weitere Insulinspritze mit dem 30 μL Aliquot dextran und stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in der gefüllten Spritze befinden. 2. Injektion der Schwanzvene Betäuben Sie die Maus mit Isofluran (4% Induktion, 1,5% Erhaltung) oder Ketamin / Xylazin (60 mg / kg; 10 mg / kg; i.p.) und tragen Sie Augengleitgel auf. Ketamin / Xylazin wird für stabilere Blutflussmessungen während der Bildgebung empfohlen und die Dosis kann auf 90 mg / kg erhöht werden; 10 mg/kg Ketamin/Xylazin für längere Bildgebungssitzungen. Wenn sich die Maus auf der chirurgischen Ebene der Anästhesie befindet, legen Sie einen mit warmem Wasser gefüllten Handschuh auf den Schwanz, um die seitliche Vene zu erweitern. Entfernen Sie den Handschuh nach 30 s und reinigen Sie den Schwanz mit Ethanol. Legen Sie den Schwanz zwischen Daumen und Mittelfinger. Geben Sie Druck mit dem Zeigefinger auf den Schwanz, um die Vene zu erweitern. Nehmen Sie mit der anderen Hand die Nadel des Katheters mit einer Handzette auf, die die Lünette nach oben zur Decke ausrichtet. Nachdem Sie den Schwanz mit 70% Ethanol gereinigt haben, führen Sie die Nadel in einem Winkel von 0 ° sanft in die Vene ein und injizieren Sie vorsichtig Kochsalzlösung durch den Katheter, um sicherzustellen, dass die Nadel richtig platziert wird.HINWEIS: Wenn es keinen Widerstand am Kolben und keine Schwellung des Schwanzes gibt, dann ist die Nadel in der Vene. Wenn ein signifikanter Widerstand oder eine Schwellung vorliegt, sollte die Nadel entfernt werden. Die Schritte 2.2-2.5 können bis zu 3 Mal auf jeder Seite des Schwanzes wiederholt werden, wobei die 30G-Nadel am Ende des Katheters jeden zweiten Versuch ersetzt wird, bis die Platzierung korrekt ist. Sobald sich die Nadel in der Vene befindet, wechseln Sie die Kochsalzspritze am Ende des Katheters mit der Spritze, die Fluoresceindextran enthält (Schritt 1.6). Injizieren Sie das Dextran langsam in den Katheterschlauch, um sicherzustellen, dass keine Blasen in das Rohr gelangen. Wenn eine Luftblase sichtbar ist, schneiden Sie den Schlauch mit der Blase ab, um ihn zu entfernen und die Spritze wieder zusetzen. Wenn das gesamte Dextran (30 μL Aliquot) injiziert wurde, entfernen Sie die Spritze und ersetzen Sie sie durch die kochsalzhaltige Spritze. Injizieren Sie das verbleibende Dextran aus dem Schlauch in die Maus, bis kein Farbstoff mehr in der Tube vorhanden ist. Entfernen Sie die Nadel vom Schwanz und geben Sie Druck mit Gaze für 10-30 s, bis die Blutung aufhört.KRITISCH: Wenn nach 6 Versuchen die Schwanzveneninjektion nicht erfolgreich ist, sollte das Tier in einer anderen Sitzung abgebildet werden. Auch das Gesamtvolumen (Kochsalzlösung und Dextran), das in die Maus injiziert wird, sollte 100 μL nicht überschreiten. 3. Zwei-Photonen-Mikroskopie Fokussierung auf das SchädelfensterHINWEIS: Verwenden Sie Ketamin / Xylazin-Anästhesie während der Datenerfassung, da es weniger vaskuläre Wirkungen (Vasodilatation) als Isofluran hat. Wenn Sie Isofluran in den oben genannten Schritten verwenden, injizieren Sie der Maus vor der Bildgebung Ketamin / Xylazin i.p. (empfohlene Dosis, die oben beschrieben wird). Befestigen Sie die Maus mit einer Schraube durch ihren Kopfpfosten an einer Plattform mit einem Heizkissen unter dem Mikroskop. Tragen Sie Augengleitmittel auf die Augen der Maus auf. Reinigen Sie das Schädelfenster mit feuchten Dentalapplikatoren. Stellen Sie sicher, dass keine Partikel übrig sind, die den Bildgebungsprozess stören könnten. Tragen Sie Ultraschallgel auf das Fenster auf. Fokussieren Sie durch das Zwei-Photonen-Mikroskopobjektiv, bis die Pial-Blutgefäße unter dem Fenster zu sehen sind. Überprüfen Sie die Atmung der Maus und stellen Sie sicher, dass das Heizkissen ausreichend Temperaturunterstützung bietet. BilderfassungHINWEIS: Das in diesem Experiment verwendete Zwei-Photonen-Mikroskop verfügt über einen abstimmbaren Ti-Saphir-Laser zur Fluoreszenzanregung mit einer Pockel-Zelle, der die Lasermenge steuert, die die Probe erreicht. Das emittierte Licht wird durch einen 565-Langpass-Dichroit auf zwei GaAsP-Photomultiplikatorröhren (PMTs) mit 595/50-Bandpassfilter (rot) und 525/70-Bandpassfilter (grün) zur Detektion aufgeteilt.Die in den Schritten 3.2 bis 3.4 beschriebenen Verfahren werden mit einer spezifischen Software des Zwei-Photonen-Mikroskops aus diesem Protokoll durchgeführt (siehe Materialtabelle). Diese Schritte können an andere Mikroskopsoftware und -geräte angepasst werden. Stellen Sie bei ausgeschalteter Raumbeleuchtung die gewünschte Wellenlänge in der Mikroskopsoftware auf 990 nm ein, um sowohl RCaMP als auch Fluorescein-Dextran anzuregen, indem Sie auf die 2-P-Laserbox klicken. Stellen Sie die Laserleistung ein, indem Sie auf den Abschnitt Power/Gain box/Lasers klicken und die Pockels 1-Zellenspannung auf 30% oder einen Wert von 300 auf einer Skala von 1000 einstellen. Die Laserleistung, die bei dieser Einstellung die Probe erreicht, wurde zuvor auf ~30 mW festgelegt. Stellen Sie die PMT-Detektorempfindlichkeit ein, indem Sie auf den Abschnitt Power/Gain box/PMTs klicken und den Wert auf 700-800 einstellen.HINWEIS: Diese Werte können relativ zur Intensität der fluoreszierenden Probe angepasst werden und sollten vor dem Einschalten der Lichter im Raum auf Null eingestellt werden. Gehen Sie zum Abschnitt Bildauflösung und klicken Sie auf die Auflösung von 512 x 512 für eine größere Bildgröße. Klicken Sie auf 2-P Laser/Öffnen, um den 2-P Laserverschluss zu öffnen. Gehen Sie zum Abschnitt Scannen und klicken Sie auf die Schaltfläche Live-Scan.HINWEIS: Live-Scanning mit diesen Parametern und höherer Auflösung, RCaMP-positive Wandzellen und das fluoreszierend markierte Blutplasma sind zu sehen. Wenn das Signal schwach ist, kann der Pockel-Wert erhöht werden, bis das Bild klar ist.KRITISCH: In den oberflächlichen Gewebeschichten sollte die Laserleistung 50 mW nicht überschreiten, was in den Pockels-Zelleinstellungen in diesem Beispiel etwa 600 beträgt. Erwerb eines Tiefenstapels der Wandzellen und des GefäßnetzwerksHINWEIS: Der Erwerb eines Tiefenstapels wird empfohlen, um Perizyten im Gefäßnetzwerk richtig zu lokalisieren. Umhüllende Perizyten befinden sich auf den ersten bis vierten Zweigen der eindringenden Arteriole7,8,9. Die in diesem Protokoll verwendete Mikroskopsoftware bezeichnet Tiefenstapel als “Z-Serie”. Bewegen Sie das Mikroskopobjektiv in die X-, Y- und Z-Ebene, lokalisieren Sie eine große Arterie auf der Oberfläche des Gehirns basierend auf der glatten Muskelzellmarkierung von RCaMP. Klicken Sie auf das Feld Z-Serie. Konzentrieren Sie sich auf die Oberseite des Gewebes in der Nähe der Pialgefäße, stellen Sie dies als Nullpunkt und oben auf dem Stapel der Z-Serie ein, indem Sie auf den Abschnitt Aktuelle Z-Serie / Startposition [μm] klicken. Klicken Sie auf das Kästchen mit vier schwarzen Streifen und einem roten Streifen auf der Oberseite. Konzentrieren Sie sich im Gewebe auf die gewünschte Tiefe und stellen Sie diese als Unterseite des Stapels ein, indem Sie auf den Abschnitt Aktuelle Z-Serie/Stoppposition [μm] klicken. Klicken Sie auf das Kästchen mit vier schwarzen Streifen und einem roten Streifen auf der Unterseite. Stellen Sie die Dicke jeder Bildebene (Schrittgröße) auf 1-2 μm ein, indem Sie den gewünschten Wert in das Feld unter der Schaltfläche “Schrittgröße” eingeben (die SchaltflächeSchrittgröße ist im Abschnitt Z-Serie / Aktuelle Z-Serielokalisiert ). Dadurch wird die Anzahl der Bilder definiert, die im Stapel erfasst werden. Stellen Sie die Laserleistung so ein, dass sie exponentiell ansteigen, wenn sich das Mikroskop tiefer durch den Stapel bewegt, indem Sie auf das Feld Laser-/PMT-Kompensation klicken und Relativ (exponentieller Gradient) auswählen. Benennen Sie die Datei, wählen Sie einen Ordner zum Speichern aus und klicken Sie auf Z-Serie starten. Öffnen Sie nach der Erfassung die Z-Serie in der Bildbearbeitungssoftware. Verschmelzen Sie die beiden Kanäle als farbige Bilder und scannen Sie den Stapel auf der Suche nach Perizyten und Blutgefäßen von Interesse, indem Sie in das Feld Bild | | Geteilte Kanäle; Bild | | Kanäle zusammenführen. Wählen Sie Regionen von Interesse (ROIs) aus, die Perizyten enthalten, und speichern Sie die Positionen, um diese Stellen in zukünftigen Bildgebungssitzungen wieder zu lokalisieren. Calcium-Imaging-Filmaufnahme der T-Serie (Zeit) Verwenden Sie den Tiefenstapel und die ROIs von oben als Referenz, bewegen Sie das Mikroskopobjektiv während des Live-Scan-Modus in der X-, Y- und Z-Achse, bis eine Perizyte von Interesse gefunden wird. Um einen Film mit Perizyt-Kalziumereignissen zu sammeln, erhöhen Sie die Aufnahmebildrate (>10 Bilder pro Sekunde), indem Sie zum Abschnitt Bildauflösung gehen und auf das Feld 128×128 klicken. Stellen Sie die Aufnahmedauer auf 60 s ein, indem Sie auf das Feld T-Serie klicken und die Zeit in das Dauerfeld eingeben. Klicken Sie neben dem Feld Pfad speichern auf die Schaltfläche mit drei Punkten, um den Speicherpfad mit einem eindeutigen Dateinamen zu aktualisieren. Zoomen Sie optisch auf das Gefäß, um die niedrigere Auflösung zu berücksichtigen und einen genaueren Blick auf den Perizyten zu erhalten, indem Sie den Wert im Abschnitt Optischer Zoom [mag] anpassen. Erwerben Sie die T-Serie, indem Sie auf T-Serie startenklicken. Hämodynamische Messungen mit Kymographen (Zeilenscans) Konzentrieren Sie sich im Live-Scan-Modus auf das interessierende Gefäß mit einer Auflösung von 512 x 512Pixeln. Um den Blutgefäßdurchmesser und die Geschwindigkeit der roten Blutkörperchen zu messen, klicken Sie auf den Zeilenscan, um einen eindimensionalen Scan mit dem Mikroskop zu starten. Legen Sie die Dauer des Scans (30-60 s) in Millisekunden fest. Zeichnen Sie eine Linie, die das interessierenden Gefäß teilt und sich parallel entlang des Gefäßes bewegt. Dies erzeugt einen Kymographen des Gefäßdurchmessers auf der linken Seite und Streifen der roten Blutkörperchen, die sich durch das Gefäß auf der rechten Seite bewegen.HINWEIS: Mehrere Blutgefäße können mit derselben Linie gemessen werden, solange sie sich in derselben Bildgebungsebene befinden. Benennen Sie die Datei und klicken Sie auf Linescan(s) starten, um die Daten zu erfassen. 4. Bildanalyse Calciumfilmanalyse.HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zum spektralen Entmischen (Abbildung 2) und zwei verschiedene Methoden zur Analyse von Perizyt-Calcium-Ereignissen anhand manueller, handverlesener ROIs (Abbildung 3) und automatisierte, aktivitätsbasierte ROI-Auswahl (Abbildung 4)16,17. Um die Signalpeaks mit der normalisierten Calciumspur von jedem ROI zu erkennen und zu klassifizieren, werden die Daten long-pass- und bandpassgefiltert, was dazu beiträgt, die Daten für Amplituden- und Breitenschätzungen zu glätten und auch Peaks unterschiedlicher Form zu identifizieren: Einzelpeaks, Multipeaks und Plateaus (Abbildung 3B). Die Parameter für diese Analyse können optimiert werden, um verschiedene Arten von dynamischen Zellulären Signalen zu erkennen. Die folgenden Schritte erfordern die Verwendung von Bildverarbeitungssoftware und Programmiersoftware mit Bildverarbeitungspaketen, die verschiedene Codes zur Analyse von Kalziumfilmen enthalten, wie oben erwähnt. Eine vollständige Liste der in diesem Protokoll verwendeten Programme und Pakete finden Sie in der Materialtabelle. Bilddaten von verschiedenen Arten von Mikroskopen können mit diesen Paketen importiert werden, wobei die Metadaten aus den Bildern beibehalten werden.HINWEIS: Die Schritte 4.1.1-4.1.7 beschreiben, wie SIE ROIs in einer Bildverarbeitungssoftware manuell auswählen, um sie anschließend in der manuellen Calciumanalysemethode zu verwenden (Schritt 4.1.16)Laden Sie die Calcium Imaging T-Serie in die Bildverarbeitungssoftware, indem Sie die .xml Datei in die Software-Symbolleiste ziehen. Klicken Sie auf das Feld OK. Nehmen Sie den Durchschnitt des Stapels (der Durchschnitt des Stapels wird von der Bildverarbeitungssoftware als “Z-Projektion” bezeichnet). Dies kann durch Klicken auf Image | Stapel | Z-Projektion in der Symbolleiste. Erstellen Sie ein farbiges Bild aus beiden Kanälen wie in Schritt 3.3.9. Öffnen Sie das ROI-Manager-Fenster, indem Sie in das Feld Analyse | Werkzeuge | ROI Manager, oder drücken Sie einfach den Buchstaben “T” in der Tastatur. Wählen Sie das Polygonwerkzeug aus, indem Sie auf die Polygonform in der Symbolleiste der Bildverarbeitungssoftware klicken und die sichtbaren umhüllenden Perizytstrukturen wie Soma und Prozesse skizzieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen im ROI-Manager-Fenster, um ausgewählte ROIs im ROI-Manager hinzuzufügen. Geben Sie jeder Region von Interesse einen eindeutigen Namen, indem Sie auf die Schaltfläche Umbenennen klicken, und speichern Sie sie als Zip-Ordner, der später in der Programmiersoftware geladen werden kann, indem Sie auf Mehr klicken>> | Speichern.HINWEIS: Die Schritte 4.1.8-4.1.14 beschreiben, wie die Calcium-T-Serie in die Programmierplattform importiert wird und wie die verschiedenen Fluorophore, die von den Mikroskop-PMTs detektiert werden, in verschiedene Kanäle entmischt werden (Abbildung 2). Öffnen Sie die Programmiersoftware und stellen Sie sicher, dass sich die Ordner für die Bildverarbeitungspakete auf dem Pfad befinden (siehe Materialtabelle). Importieren Sie die calcium T-Serie in die Programmiersoftware, indem Sie die Funktion BioFormats im Befehlsfenster der Programmierplattform aufrufen, wodurch das Dateiauswahlfenster automatisch geöffnet wird. Definieren Sie, was sich auf jedem Kanal befindet, indem Sie die gewünschte Nummer eingeben. In diesen Beispieldaten antwort: Kanal 1 antwort=6 (cellular_signal), Kanal 2 antwort=1 (blood_plasma). Zeichnen Sie die Daten als Film in der Programmiersoftware, um die Visualisierung durch Aufrufen der Plotfunktion zu erleichtern. Um die grüne Fluoreszenz aus Fluorescein-Dextran zu entfernen, die in den roten RCaMP-Kanal durchblutet, entmischen Sie die Kanäle im Bildverarbeitungspaket, indem Sie die Funktion unmix_chs im Befehlsfenster der Programmierplattform aufrufen. Wählen Sie einen Bereich aus, der nur Fluoreszenz aus diesem Fluorophor in Kanal 1 enthält, z. B. in diesem Fall RCaMP. Wählen Sie einen Bereich aus, der nur Fluoreszenz aus Fluorophor 2 enthält, z. B. Fluoreszein im Blutplasma in diesem Beispiel. Wählen Sie einen Hintergrundbereich aus, der keine Fluoreszenz von beiden Fluorophoren aufenthält. Dadurch wird eine spektrale Beitragsmatrix erzeugt, die auf jedes Pixel in jedem Kanal angewendet wird. Es verbessert die Lokalisierung des RCaMP-Signals erheblich, was die Erkennung von Kalziumereignissen in diesen Strukturen verbessert.HINWEIS: Wie oben erwähnt, gibt es mehrere Möglichkeiten, wie die Calcium-Bildgebungsdaten innerhalb der Bildverarbeitungspakete analysiert werden können. Die Schritte 4.1.16-4.1.23 beschreiben die Methode zur Analyse von Perizyt-Calcium-Ereignissen mit manuellen, handverlesenen ROIs. Führen Sie die zelluläre Signalanalyse für den ungemischten Kalziumfilm aus, indem Sie die CellScan-Funktion im Befehlsfenster der Programmierplattform aufrufen. Der Code fragt “Welche ROI-Erkennungsmethode möchten Sie verwenden?”. Geben Sie die Zahl 2 ein, um die handverlesenen ROIs auf die Programmierplattform zu laden. Laden Sie die interessierenden Bereiche aus dem Zip-Ordner, die zuvor von Hand aus den Perizyten ausgewählt wurden (Schritt 4.1.6). Der Code fragt “Was ist der Skalierungsfaktor?”. Bestimmen Sie den Skalierungsfaktor für die handverlesenen ROIs relativ zur zu analysierenden Bildserie und geben Sie die Anzahl der Skala ein. In diesem Beispiel ist der Skalierungsfaktor 1, da die ROIs nicht in der Größe isiert werden müssen, da sie auf Bildern mit 128 x 128 Pixeln ausgewählt wurden, die gleiche Auflösung wie der ursprüngliche Calciumfilm. Generieren Sie Diagramme jedes ROI und der normalisierten Calciumspuren in verschiedenen Farben (Abbildung 3A), indem Sie die Prozess- und Plotfunktionen im Befehlsfenster aufrufen. Wenn der Code die Mehrheit der Calciumereignisse in den einzelnen Ablaufverfolgungen nicht erkennt, ändern Sie die integrierten Parameter innerhalb des Konfigurationsoptimierungsfelds, indem Sie die Funktion opt_config aufrufen und die Werte anpassen, z. B. den Schwellenwert für die gefilterten Kurzpassdaten auf das Dreifache der Standardabweichung des Basiszeitraums, d. h. die ersten 30 Frames der T-Serie, verringern. Klicken Sie im Optimierungsfeld auf die Schaltfläche Prozess, um die neuen Parameter anzuwenden.HINWEIS: Um die Signale zu erkennen und zu klassifizieren, wird die normalisierte Calciumspur durch Langpass und Bandpass gefiltert, was hilft, die Daten für Amplituden- und Breitenschätzungen zu glätten, aber auch festzustellen, ob Signale einzelne Peaks, Multi-Peaks oder Plateaus sind (Abbildung 3B). Geben Sie die Daten als .csv Datei aus, die räumliche Informationen über die interessierenden Regionen und die Spitzen enthält, die durch Aufrufen der Funktion output_data im Befehlsfenster identifiziert wurden. Geben Sie der Datei einen eindeutigen Namen für die weitere Analyse in einem Statistikprogramm.HINWEIS: Die Schritte 4.1.24-4.1.31 beschreiben die Methode zur Analyse von perizyten Kalziumereignissen mithilfe der Analyse aktivitätsbasierter ROIs. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.8.-4.1.16, um den Calciumfilm zu importieren, die Kanäle zu entmischen und die CellScan-Funktion in der Programmierplattform aufzurufen. Der Code fragt “Welche ROI-Erkennungsmethode möchten Sie verwenden?”. Geben Sie die Zahl 6 ein, um die automatisierte Identifizierung des Interessenbereichs basierend auf der Aktivität und Änderung der Fluoreszenz in 3 Dimensionen (x, y und Zeit; “3D FLIKA Algorithmus”). Zeichnen Sie die verarbeiteten Ergebnisse, um die identifizierten Bereiche von Interesse als verschiedene Farben anzuzeigen, indem Sie die Prozess- und Plotfunktionen im Befehlsfenster aufrufen. Jeder ROI wird in Zeit und Raum unterschieden und als überlagerte Maske dargestellt (Abbildung 4). Wenn der Algorithmus KEINE ROIs erkennt, die mit dem Auge deutlich sichtbar sind, ändern Sie die integrierten Parameter in der Optimierungsbox, indem Sie die Funktion opt_config aufrufen und die Werte anpassen, z. B. den Gaußfilter erhöhen, der die Daten in der Zeit glättet (um 2 s) und den Schwellenwert für die Suche nach ROIs auf das 3-fache der Standardabweichung der Baseline verringern. Wählen Sie die Prozessschaltfläche im Optimierungsfeld aus, um die neuen Parameter anzuwenden. Mit dem Optimierungsprozess sollen mehr ROIs identifiziert werden (Abbildung 4B). Zeichnen Sie die ROIs als Film auf, um die Aktivitätsbereiche (in Regenbogenfarben umrissen) eindeutig zu identifizieren, indem Sie den Modus der Standardbox innerhalb des Optimierungsfensters zur weiteren Visualisierung in Film ändern. Geben Sie die Daten als CSV-Datei aus, indem Sie die Funktion output_data im Befehlsfenster aufrufen. Diese Datei kann in einem Statistikprogramm weiter analysiert werden.HINWEIS: Die Analyseparameter können an jede Art von dynamischem Mobilfunksignal (Kalzium, FRET-Verhältnisse usw.) angepasst werden. Alle oben genannten Schritte können mit einfachem Programmiercode automatisiert werden, um viele Kalziumfilme mit den gleichen Einstellungen zu stapeln. Zeilenscan Blutflussanalyse. Importieren Sie die in Abschnitt 3.5 erfasste Zeilenscan-Kymograph-Datendatei in die Programmiersoftware. Der Code fragt “Was wird auf Kanal 1 und 2 gezeigt?”. Definieren Sie, was sich auf jedem Kanal befindet, wenn Sie dazu aufgefordert werden. In diesem Beispiel ist Kanal 1 leer (Typ 0) und Kanal 2 ist blood_plasma (Typ 1). Führen Sie die Durchmesseranalysefunktion für den Zeilenscan aus, indem Sie die LineScanDiam-Funktion aufrufen, die ein Feld öffnet, um den Bereich auszuwählen, der dem Durchmesser im Kymographen entspricht (Abbildung 5B, links). Zeichnen Sie eine Box außerhalb der Kymograph-Fluoreszenzgrenzen, die dem Gefäßdurchmesser entspricht. Verarbeiten Sie diese Datenklasse, indem Sie die Prozessfunktion aufrufen, um die volle Breite bei halben Maxima für den Behälterdurchmesser zu messen und ein Diagramm (Abbildung 5C) mit der Plotfunktion zu generieren. Geben Sie die Daten als CSV-Datei aus, indem Sie die Funktion output_data im Befehlsfenster aufrufen. Diese Datei kann in einem Statistikprogramm weiter analysiert werden. Führen Sie die Geschwindigkeitsradontransformationsanalyse aus, indem Sie die LineScanVel-Funktion aufrufen, die ein Feld öffnet, um den Bereich auszuwählen, der der RBC-Geschwindigkeit im Kymographen entspricht (Abbildung 5B, rechts). Zeichnen Sie ein Feld innerhalb des Randes der Kymographenfluoreszenz, das der Gefäßgeschwindigkeit entspricht. Verarbeiten Sie diese Datenklasse, indem Sie die Prozessfunktion aufrufen, um die Geschwindigkeit, den Fluss und die lineare Dichte der roten Blutkörperchen aus dem Winkel der Streifen in der Fluoreszenz zu berechnen. Generieren Sie ein Diagramm (Abbildung 5D) mit der Plotfunktion. Geben Sie die Daten als CSV-Datei aus, indem Sie die Funktion output_data im Befehlsfenster aufrufen. Diese Datei kann in einem Statistikprogramm weiter analysiert werden.HINWEIS: Die Kymographen müssen eine klare Fluoreszenz mit genau definierten Kanten zwischen den schwarzen Räumen aufweisen, damit die Durchmesser- und Geschwindigkeitsanalyse genau ist (Abbildung 5A, B). Es ist sehr wichtig, die orthogonalen und parallelen Linien präzise zu zeichnen, da sonst eine zuverlässige Analyse der Kymographen nicht möglich ist. Ähnlich wie bei der Calciumanalyse mit den Bildverarbeitungsalgorithmen können die Parameter für Durchmesser- und Geschwindigkeitsberechnungen optimiert werden.