Calcium péricyte cérébral et imagerie hémodynamique chez des souris transgéniques in vivo

Toutes les procédures impliquant des animaux de laboratoire décrites ci-dessous ont été approuvées par le Comité des soins aux animaux de l’Université du Manitoba, qui est régi par le Conseil canadien des soins aux animaux. 1. Configuration et préparation de la procédure REMARQUE: Les articles suivants sont requis pour une injection de cathéter veineux caudale: seringues à insuline, un morceau de tube PE10 de 15 cm, aiguilles de 30 G, gaze, solution saline, pinces, colorant dextran à la fluorescéine verte, pince et ciseaux. De plus, préparez une aiguille avec une anesthésie à la kétamine / xylazine qui sera injectée avant la séance d’imagerie. CRITIQUE : Tous les matériaux et équipements des étapes 1 et 2 doivent être stérilisés avant l’utilisation par autoclavage ou rinçage à l’éthanol à 70 %. Si la pince ne peut pas être correctement stérilisée, l’utilisation d’une paire de grands porte-aiguilles est recommandée. L’assemblage du cathéter doit être effectué avec une pince et une pince pour éviter les perforations accidentelles de l’aiguille. Couper environ 15-20 cm de tube en polyéthylène, PE10 (I.D. 28 mm; O.D. 61 mm). Remplissez une seringue à insuline de 27 G avec une solution saline à 0,9 % et encercez l’aiguille de la seringue dans l’extrémité du tube en polyéthylène. Poussez la solution saline à travers le tube, en vous assurant qu’il n’y a pas de fuites. À l’aide d’une pince, pliez une aiguille de 30 G (0,3 mm x 25 mm) d’avant en arrière jusqu’à ce qu’elle se détache du moyeu. L’aiguille doit être propre et sans courbure. En tenant l’aiguille avec une pince, insérez soigneusement l’aiguille dans l’extrémité du tube PE10 qui est attaché à la seringue remplie de solution saline et retirez les bulles d’air. Il s’agit du cathéter pour injection. Filtrer 30 μL de 2,5 % (p/v) de fluorescéine dextran à travers un filtre de 13 à 25 μm avant l’injection. Remplissez une autre seringue à insuline avec l’aliquote de 30 μL de dextran et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans la seringue remplie. 2. Injection de veine caudale Anesthésier la souris avec de l’isoflurane (4 % d’induction, 1,5 % d’entretien) ou de la kétamine/xylazine (60 mg/kg ; 10 mg/kg ; i.p.) et appliquer un gel lubrifiant pour les yeux. La kétamine/xylazine est recommandée pour des mesures de débit sanguin plus stables pendant l’imagerie et la dose peut être augmentée à 90 mg/kg; 10 mg/kg de kétamine/xylazine pour des séances d’imagerie plus longues. Lorsque la souris est au plan chirurgical de l’anesthésie, placez un gant rempli d’eau tiède sur la queue pour dilater la veine latérale. Retirez le gant après 30 s et nettoyez la queue avec de l’éthanol. Placez la queue entre le pouce et le majeur. Fournir une pression avec l’index sur la queue pour dilater la veine. Avec l’autre main, ramassez l’aiguille du cathéter avec des pinces orientant la lunette vers le haut vers le plafond. Après avoir nettoyé la queue avec de l’éthanol à 70%, insérez doucement l’aiguille dans la veine à un angle de 0 ° et injectez doucement une solution saline à travers le cathéter pour vous assurer que l’aiguille est placée correctement.REMARQUE: S’il n’y a pas de résistance sur le piston et pas de gonflement de la queue, l’aiguille est dans la veine. S’il y a une résistance ou un gonflement important, l’aiguille doit être retirée. Les étapes 2.2 à 2.5 peuvent être répétées jusqu’à 3 fois de chaque côté de la queue, en remplaçant l’aiguille 30G à la fin du cathéter tous les deux essais jusqu’à ce que le placement soit correct. Une fois l’aiguille dans la veine, remplacer la seringue saline à l’extrémité du cathéter par la seringue contenant de la fluorescéine dextran (étape 1.6). Injectez lentement le dextran dans le tube du cathéter, en veillant à ce qu’aucune bulle ne pénètre dans le tube. Si une bulle d’air est apparente, coupez le tube contenant la bulle pour l’enlever et rattez la seringue. Lorsque tout le dextran (aliquote de 30 μL) a été injecté, retirez la seringue et remplacez-la par la seringue saline. Injectez le dextran restant du tube dans la souris jusqu’à ce qu’il ne reste plus de colorant dans le tube. Retirez l’aiguille de la queue et pressez avec de la gaze pendant 10 à 30 s jusqu’à ce que le saignement cesse.CRITIQUE: Si, après 6 tentatives, l’injection de la veine caudale échoue, l’animal doit être imagé lors d’une autre séance. De plus, le volume total (solution saline et dextran) injecté dans la souris ne doit pas dépasser 100 μL. 3. Microscopie à deux photons Se concentrer sur la fenêtre crânienneREMARQUE: Utilisez une anesthésie à la kétamine / xylazine lors de l’acquisition des données, car elle a moins d’effets vasculaires (vasodilatation) que l’isoflurane. Si vous utilisez de l’isoflurane dans les étapes ci-dessus, injecter à la souris de la kétamine/xylazine i.p. (dose recommandée décrite ci-dessus) avant l’imagerie. Fixez la souris avec une vis à travers son poteau de tête à une plate-forme avec un coussin chauffant sous le microscope. Appliquez du lubrifiant pour les yeux sur les yeux de la souris. Nettoyez la fenêtre crânienne avec des applicateurs dentaires humides. Assurez-vous qu’il n’y a plus de particules qui pourraient interférer avec le processus d’imagerie. Appliquez un gel à ultrasons sur la fenêtre. Concentrez-vous à travers l’objectif du microscope à deux photons jusqu’à ce que les vaisseaux sanguins piaux puissent être vus sous la fenêtre. Vérifiez la respiration de la souris et assurez-vous que le coussin chauffant fournit un support de température suffisant. Acquisition d’imagesREMARQUE: Le microscope à deux photons utilisé dans cette expérience a un laser Ti-Sapphire accordable pour l’excitation de fluorescence avec une cellule de Pockel qui contrôle la quantité de laser qui atteint l’échantillon. La lumière émise est divisée par un dichroïque à long passage de 565 en deux tubes photomultiplicateurs GaAsP (PMT) avec filtre passe-bande 595/50 (rouge) et filtre passe-bande 525/70 (vert) pour la détection.Les procédures décrites aux étapes 3.2 à 3.4 sont effectuées à l’aide d’un logiciel spécifique du microscope à deux photons de ce protocole (voir Table des matériaux). Ces étapes peuvent être adaptées à d’autres logiciels et équipements de microscope. Lorsque les lumières de la pièce sont éteintes, réglez la longueur d’onde souhaitée dans le logiciel du microscope sur 990 nm pour exciter à la fois le RCaMP et la fluorescéine-dextran en cliquant sur la boîte laser 2-P. Réglez la puissance du laser en cliquant sur la section Puissance / Gain /Lasers et en ajustant la tension de la cellule Pockels 1 à 30% ou une valeur de 300 sur une échelle de 1000. La puissance laser qui atteint l’échantillon à ce réglage a été préalablement déterminée à environ 30 mW. Réglez la sensibilité du détecteur PMT en cliquant sur la section Puissance / Gain /PMT et en ajustant la valeur à 700-800.REMARQUE: Ces valeurs peuvent être ajustées par rapport à l’intensité de l’échantillon fluorescent et doivent être réglées à zéro avant d’allumer les lumières dans la pièce. Allez dans la section Résolution d’image et cliquez sur la résolution 512 x 512 pour une taille d’image plus grande. Cliquez sur Laser 2-P/Ouvrir pour ouvrir l’obturateur Laser 2-P. Allez dans la section Numérisation et cliquez sur le bouton Analyse en direct.REMARQUE: Le balayage en direct avec ces paramètres et une résolution plus élevée, les cellules murales RCaMP positives et le plasma sanguin marqué par fluorescence peuvent être vus. Si le signal est faible, la valeur de pockel peut être augmentée jusqu’à ce que l’image soit claire.CRITIQUE: Dans les couches tissulaires superficielles, la puissance du laser ne doit pas dépasser 50 mW, soit environ 600 dans les paramètres des cellules de Pockels dans cet exemple. Acquisition d’une pile de profondeur des cellules murales et du réseau vasculaireREMARQUE: L’acquisition d’une pile de profondeur est recommandée pour localiser correctement les péricytes dans le réseau vasculaire. Les péricytes gainants sont situés sur les première à quatrième branches de l’artériole pénétrante7,8,9. Le logiciel de microscope utilisé dans ce protocole fait référence aux piles de profondeur sous le nom de « série Z ». En déplaçant l’objectif du microscope dans les plans X, Y et Z, localisez une grande artère à la surface du cerveau en fonction du marquage des cellules musculaires lisses du RCaMP. Cliquez sur la case Série Z. Concentrez-vous en haut du tissu près des vaisseaux piaux, définissez-le comme point zéro et haut de la pile de la série Z en cliquant sur la section Current Z-series/ Start position [μm]. Cliquez sur la boîte avec quatre bandes noires et une bande rouge sur le dessus. Concentrez-vous vers le bas dans le tissu à la profondeur souhaitée et définissez-la comme le bas de la pile en cliquant sur la section Current Z-series/Stop position [μm]. Cliquez sur la boîte avec quatre bandes noires et une bande rouge en bas. Réglez l’épaisseur de chaque plan d’image (taille de pas) sur 1-2 μm en tapant la valeur souhaitée dans la case sous le bouton “Taille de pas” (le bouton Taille depas est localisé dans la section Série Z / Série Z actuelle). Cela définira le nombre d’images acquises dans la pile. Réglez la puissance du laser pour qu’elle augmente de manière exponentielle à mesure que le microscope se déplace plus profondément dans la pile en cliquant sur la case Compensation laser/PMT et en sélectionnant Relatif (gradient exponentiel). Nommez le fichier, choisissez un dossier pour l’enregistrer et cliquez sur Démarrer la série Z. Après l’acquisition, ouvrez la série Z dans le logiciel de traitement d’imagerie. Fusionnez les deux canaux sous forme d’images colorées et parcourez la pile à la recherche de péricytes et de vaisseaux sanguins d’intérêt en cliquant dans la case Image | | de couleur Canaux divisés; | de l’image | de couleur Fusionner les canaux. Sélectionnez les régions d’intérêt (ROI) qui contiennent des péricytes et enregistrez les positions pour aider à localiser à nouveau ces points lors de futures sessions d’imagerie. Acquisition de films d’imagerie calcique de la série T (temps) En utilisant la pile de profondeur et les rois d’en haut comme référence, déplacez l’objectif du microscope dans les axes X, Y et Z en mode de balayage en direct jusqu’à ce qu’un péricyte d’intérêt soit trouvé. Pour collecter un film d’événements de calcium péricyte, augmentez la fréquence d’images d’acquisition (>10 images par seconde) en allant dans la section Résolution d’image et en cliquant sur la case 128×128. Réglez la durée de l’imagerie sur 60 s en cliquant sur la case série T et en entrant l’heure dans la zone durée. À côté de la zone Enregistrer le chemin, cliquez sur le bouton avec trois points pour mettre à jour le chemin d’enregistrement avec un nom de fichier unique. Zoom optique sur le récipient pour tenir compte de la résolution inférieure et pour obtenir une vue plus rapprochée du péricyte en ajustant la valeur dans la section Zoom optique [mag]. Acquérez la série T en cliquant sur Démarrer la série T. Mesures hémodynamiques avec kymographes (balayages linéaires) Concentrez-vous sur le navire d’intérêt à une résolution de 512 x 512pixels en mode Live Scan. Pour mesurer le diamètre des vaisseaux sanguins et la vitesse des globules rouges, cliquez sur le balayage linéaire pour lancer un balayage unidimensionnel au microscope. Définissez la durée de l’analyse (30-60 s) en millisecondes. Tracez une ligne qui coupe en deux le navire d’intérêt et se déplace parallèlement le long du navire. Cela générera un kymographe du diamètre du vaisseau à gauche et des stries des globules rouges se déplaçant à travers le vaisseau à droite.REMARQUE: Plusieurs vaisseaux sanguins peuvent être mesurés avec la même ligne tant qu’ils sont dans le même plan d’imagerie. Nommez le fichier et cliquez sur le(s) Start Linescan(s) pour acquérir les données. 4. Analyse d’images Analyse de film calcique.REMARQUE : Ce protocole décrit les étapes du démélange spectral (Graphique 2) et deux méthodes différentes pour analyser les événements de calcium péricytaire d’ensaissage à l’aide de ROI manuels sélectionnés à la main (Graphique 3) et une sélection automatisée du retour sur investissement basée sur l’activité (Graphique 4)16,17. Afin de détecter et de classer les pics de signal avec la trace de calcium normalisée de chaque retour sur investissement, les données sont filtrées passe-long et passe-bande, ce qui permet de lisser les données pour les estimations d’amplitude et de largeur et également d’identifier les pics de différentes formes: pics simples, pics multiples et plateaux (Graphique 3B). Les paramètres de cette analyse peuvent être optimisés pour détecter différents types de signaux cellulaires dynamiques. Les étapes ci-dessous nécessiteront l’utilisation d’un logiciel de traitement d’image et d’un logiciel de programmation avec des packages de traitement d’image contenant différents codes pour analyser les films de calcium comme mentionné ci-dessus. Veuillez consulter le tableau des matériaux pour obtenir la liste complète des programmes et des packages utilisés dans ce protocole. Les données d’imagerie de différents types de microscopes peuvent être importées avec ces packages conservant les métadonnées des images.REMARQUE : Les étapes 4.1.1 à 4.1.7 décrivent comment sélectionner manuellement les retours sur investissement dans un logiciel de traitement d’images en fonction d’une utilisation ultérieure dans la méthode d’analyse manuelle du calcium (étape 4.1.16)Chargez la série T d’imagerie calcique dans le logiciel de traitement d’image en faisant glisser le fichier .xml vers la barre d’outils du logiciel. Cliquez sur la case OK. Prenez la moyenne de la pile (la moyenne de la pile est étiquetée comme «projection Z» par le logiciel de traitement d’image). Cela peut être fait en cliquant sur Image | Piles | Projection Z dans la barre d’outils. Créez une image colorée à partir des deux canaux comme à l’étape 3.3.9. Ouvrez la fenêtre gestionnaire de retour sur investissement en cliquant dans la case Analyser | Outils | ROI Manager,ou simplement en appuyant sur la lettre «T» dans le clavier. Sélectionnez l’outil polygone en cliquant sur la forme du polygone dans la barre d’outils du logiciel de traitement d’image et tracez les structures péricytaires en gainage visibles, telles que le soma et les processus. Cliquez sur le bouton Ajouter situé dans la fenêtre du gestionnaire de retour sur investissement pour ajouter les retours sur investissement sélectionnés dans le gestionnaire de retour sur investissement. Donnez à chaque région d’intérêt un nom unique en cliquant sur le bouton Renommer et enregistrez-les en tant que dossier zip qui peut être chargé ultérieurement dans le logiciel de programmation en cliquant sur Plus>> | Enregistrer.REMARQUE: Les étapes 4.1.8 à 4.1.14 décrivent comment importer la série T de calcium dans la plate-forme de programmation et comment mélanger les différents fluorophores détectés par les PMT du microscope dans différents canaux(Figure 2). Ouvrez le logiciel de programmation et assurez-vous que les dossiers des packages de traitement d’image sont sur le chemin (voir Tableau des matériaux). Importez la série T de calcium dans le logiciel de programmation en appelant la fonction BioFormats dans la fenêtre de commande de la plate-forme de programmation, qui ouvre automatiquement la fenêtre de sélection de fichier. Définissez ce qui se trouve sur chaque canal en entrant le numéro souhaité. Dans cet exemple de données, Channel 1 answer=6 (cellular_signal), Channel 2 answer=1 (blood_plasma). Tracez les données sous forme de film dans le logiciel de programmation pour faciliter la visualisation en appelant la fonction de tracé. Pour éliminer la fluorescence verte de la fluorescéine-dextran qui saigne dans le canal RCaMP rouge, démixez les canaux du package de traitement d’image en appelant la fonction unmix_chs dans la fenêtre de commande de la plate-forme de programmation. Sélectionnez une région qui ne contient que la fluorescence de ce fluorophore dans le canal 1, comme RCaMP dans ce cas. Sélectionnez une région qui ne contient que la fluorescence du fluorophore 2, telle que la fluorescéine dans le plasma sanguin dans cet exemple. Sélectionnez une zone d’arrière-plan qui n’a pas de fluorescence de l’un ou l’autre fluorophore. Cela génère une matrice de contribution spectrale qui est appliquée à chaque pixel de chaque canal. Il améliore considérablement la localisation du signal RCaMP, ce qui améliorera la détection des événements calciques dans ces structures.REMARQUE: Comme mentionné ci-dessus, il existe plusieurs façons d’analyser les données d’imagerie calcique dans les packages de traitement d’image. Les étapes 4.1.16 à 4.1.23 décrivent la méthode d’analyse des événements de calcium péricytaire en enseumant à l’aide d’un ROI manuel sélectionné à la main. Exécutez l’analyse de signalisation cellulaire sur le film de calcium non mélangé en appelant la fonction CellScan dans la fenêtre de commande de la plate-forme de programmation. Le code demandera « Quelle méthode de détection du retour sur investissement souhaitez-vous utiliser? ». Tapez le chiffre 2 pour charger les rois sélectionnés à la main sur la plate-forme de programmation. Chargez les régions d’intérêt à partir du dossier zip qui ont été sélectionnées à la main dans les péricytes précédemment (étape 4.1.6). Le code demandera « Quel est le facteur d’échelle? ». Déterminez le facteur d’échelle pour les rois sélectionnés à la main par rapport à la série d’images analysée et tapez le numéro de l’échelle. Dans cet exemple, le facteur d’échelle est de 1 car les rois n’ont pas besoin d’être redimensionnés puisqu’ils ont été sélectionnés sur des images de 128×128 pixels, la même résolution que le film de calcium d’origine. Générez des graphiques de chaque roi et des traces de calcium normalisées de différentes couleurs(Figure 3A)en appelant les fonctions de processus et de tracé dans la fenêtre de commande. Si le code ne détecte pas la majorité des événements calciques dans les traces individuelles, modifiez les paramètres intégrés dans la zone d’optimisation de la configuration en appelant la fonction opt_config et en ajustant les valeurs, par exemple en diminuant le seuil pour les données filtrées passe-court à trois fois l’écart-type de la période de référence, qui correspond aux 30 premières images de la série T. Sélectionnez le bouton Processus dans la zone d’optimisation pour appliquer les nouveaux paramètres.REMARQUE: Afin de détecter et de classer les signaux, la trace de calcium normalisée est filtrée en passe longue et passe-bande, ce qui permet de lisser les données pour les estimations d’amplitude et de largeur, mais aussi de déterminer si les signaux sont des pics simples, des pics multiples ou des plateaux(Figure 3B). Sortez les données sous la forme d’un fichier .csv contenant des informations spatiales sur les régions d’intérêt et les pics identifiés en appelant la fonction output_data dans la fenêtre de commande. Donnez au fichier un nom unique pour une analyse plus approfondie dans un programme de statistiques.REMARQUE : Les étapes 4.1.24 à 4.1.31 décrivent la méthode d’analyse des événements de calcium péricytaire en enseumant à l’aide de l’analyse des ROI basés sur l’activité. Répétez les étapes 4.1.8.-4.1.16 pour importer le film de calcium, démixer les canaux et appeler la fonction CellScan dans la plate-forme de programmation. Le code demandera « Quelle méthode de détection du retour sur investissement souhaitez-vous utiliser? ». Tapez le chiffre 6 pour sélectionner l’identification automatisée de la région d’intérêt en fonction de l’activité et du changement de fluorescence en 3 dimensions (x, y et temps; « Algorithme FLIKA 3D »). Tracez les résultats traités pour afficher les régions d’intérêt identifiées sous forme de couleurs différentes en appelant les fonctions de processus et de tracé dans la fenêtre de commande. Chaque ROI se distingue dans le temps et l’espace et représenté sous la forme d’un masque superposé(Figure 4). Si l’algorithme ne détecte pas les rois clairement visibles à l’œil, modifiez les paramètres intégrés dans la zone d’optimisation en appelant la fonction opt_config et en ajustant les valeurs, par exemple en augmentant le filtre gaussien qui lisse les données dans le temps (de 2 s) et en diminuant le seuil de recherche de retour sur investissement à 3 fois l’écart type de la ligne de base. Sélectionnez le bouton de processus dans la zone d’optimisation pour appliquer les nouveaux paramètres. Avec le processus d’optimisation, davantage de retours sur investissement doivent être identifiés (Figure 4B). Tracez les rois sous forme de film pour identifier clairement les zones d’activité (soulignées en couleurs arc-en-ciel) en changeant le mode de la boîte par défaut en film dans la fenêtre d’optimisation pour une visualisation plus poussée. Extrayez les données sous forme de fichier csv en appelant la fonction output_data dans la fenêtre de commande. Ce fichier peut être analysé plus en détail dans un programme de statistiques.REMARQUE: Les paramètres d’analyse peuvent être ajustés pour s’adapter à tout type de signal cellulaire dynamique (calcium, rapports FRET, etc.). Toutes les étapes ci-dessus peuvent être automatisées avec un code de programmation simple afin de traiter par lots de nombreux films de calcium avec les mêmes paramètres. Analyse du flux sanguin par balayage linéaire. Importez le fichier de données kymographe à balayage linéaire acquis à la section 3.5 dans le logiciel de programmation. Le code demandera « Qu’est-ce qui est montré sur les canaux 1 et 2? ». Définissez ce qui se trouve sur chaque canal lorsque vous y êtes invité. Dans cet exemple, le canal 1 est vide (type 0) et le canal 2 est blood_plasma (type 1). Exécutez la fonction d’analyse de diamètre sur le balayage de ligne en appelant la fonction LineScanDiam, qui ouvre une boîte pour sélectionner la zone qui correspond au diamètre dans le kymographe (Figure 5B, à gauche). Dessinez une boîte à l’extérieur des limites de fluorescence du kymographe qui correspond au diamètre du vaisseau. Traitez cette classe de données en appelant la fonction de processus afin de mesurer la pleine largeur à un demi-maximum pour le diamètre du récipient et générez un tracé(Figure 5C)avec la fonction de tracé. Extrayez les données sous forme de fichier csv en appelant la fonction output_data dans la fenêtre de commande. Ce fichier peut être analysé plus en détail dans un programme de statistiques. Exécutez l’analyse de transformation de la vitesse du radon en appelant la fonction LineScanVel, qui ouvre une boîte pour sélectionner la zone qui correspond à la vitesse RBC dans le kymographe (Figure 5B, à droite). Dessinez une boîte à l’intérieur de la bordure de la fluorescence du kymographe qui correspond à la vitesse du vaisseau. Traitez cette classe de données en appelant la fonction de processus afin de calculer la vitesse, le flux et la densité linéaire des globules rouges à partir de l’angle des stries dans la fluorescence. Générez un tracé (Figure 5D) avec la fonction de tracé. Extrayez les données sous forme de fichier csv en appelant la fonction output_data dans la fenêtre de commande. Ce fichier peut être analysé plus en détail dans un programme de statistiques.REMARQUE: Les kymographes doivent avoir une fluorescence claire avec des bords bien définis entre les espaces noirs pour que l’analyse du diamètre et de la vitesse soit précise (Figure 5A, B). Il est très important de dessiner les lignes orthogonales et parallèles de manière précise, sinon une analyse fiable des kymographes ne sera pas possible. Semblable à l’analyse du calcium avec les algorithmes de traitement d’image, les paramètres pour les calculs de diamètre et de vitesse peuvent être optimisés.