Denne protokol præsenterer trin til at erhverve og analysere fluorescerende calciumbilleder fra hjernen, der opvarmer pericytter og blodgennemstrømningsdata fra nærliggende blodkar i bedøvede mus. Disse teknikker er nyttige til undersøgelser af vægmalericellefysiologi og kan tilpasses til at undersøge calciumtransienter i enhver celletype.
Nylige fremskridt inden for proteinbiologi og musegenetik har gjort det muligt at måle intracellulære calciumudsving i hjerneceller in vivo og at korrelere dette med lokal hæmodynamik. Denne protokol bruger transgene mus, der er blevet udarbejdet med et kronisk kranievindue og udtrykker den genetisk kodede calciumindikator, RCaMP1.07, under den α-glatte muskel actin promotor til specifikt at mærke vægmalericeller, såsom vaskulære glatte muskelceller og ophedning pericytter. Trin er skitseret om, hvordan man forbereder en hale venekateter til intravenøs injektion af fluorescerende farvestoffer til at spore blodgennemstrømningen, samt hvordan man måler hjernen pericyt calcium og lokale blodkar hæmodynamik (diameter, rød blodlegemer hastighed, osv.) af to foton mikroskopi in vivo gennem kranievinduet i ketamin / xylazin anæstesiiserede mus. Endelig gives der oplysninger til analyse af calciumudsving og blodgennemstrømningsfilm via billedbehandlingsalgoritmerne udviklet af Barrett et al. 2018 med vægt på, hvordan disse processer kan tilpasses andre cellulære billeddata.
Centralnervesystemet vaskulatur består af gennemtrængende arterioler, kapillærer, og stigende venules. Inden for dette netværk, vægmaleri celler såsom vaskulære glatte muskelceller omslutter arterioles og pericytter udvide cellulære processer langs de første arteriole grene og kapillærer1. Pericytter synes at have flere roller i hjernen, herunder vedligeholdelse af blod -hjerne-barrieren1,2, migration og motilitet3, potentielle stamcelleegenskaber, og regulering af hjernens blodgennemstrømning4,5,6. Mange af pericytes funktionelle roller er blevet knyttet til udsving i intracellulært calcium , der kan regulere udvidelse eller sammentrækning af disse celler4,5,6.
Flere nylige undersøgelser har fastsat kriterier for at identificere forskellige typer hjerne pericytter7,8. Vægmalericeller inden for de første 4 grene af gennemtrængende arterioler opvarmer pericytter baseret på deres udtryk for det kontraktile protein α-smooth muskel actin (αSMA) og deres fremspringende, ægformede somata med processer, der ombrydes omkring kar7,8,9. For at visualisere calciumudsving i ensheathing pericytter bruger denne protokol en ny transgen muselinje, Acta2-RCaMP1.07, også kendt som Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Disse mus udtrykker den røde genetisk kodede calciumindikator, RCaMP1.07, i αSMA udtrykke celler (vaskulære glatte muskelceller og ensheathing pericytter). Avlskolonier opretholdes ved at krydse noncarrier dyr med hemizygotes. RCaMP1.07 er et rødt fluorescerende protein med et calmodulin bindende domæne, som øger fluorescensen ved binding til det intracellulære calcium10,11. Denne protokol skitserer trinene for kombineret calciumbilleddannelse af ensheathing pericytter og blodgennemstrømningsmålinger ved to fotonmikroskopi, herunder procedurer for haleveninindsprøjtning af fluorescerende farvestoffer, mikroskopbilledopsamling i bedøvede mus og dataanalyse med programmeringsplatforme (Figur 1). Disse teknikker er nyttige til at behandle spørgsmål om vægmalericellefysiologi, men kan tilpasses til at studere calciumtransienter i enhver celletype i hjernen eller et andet organsystem.
En 10 måneder gammel kvindelig Acta2-RCaMP1.07 mus blev brugt til eksperimentet præsenteret i denne artikel. Musen gennemgik kirurgi for kronisk kranievindue og hoved post implantation to måneder før. Detaljer for den kirurgiske protokol diskuteres i tidligere undersøgelser12,13 og lignende procedurer er blevet udført i andre tidligere offentliggjorte protokoller14,15. Vaskulaturen er mærket med grøn fluorescein-Dextran (70.000 MW, anionisk opløsning, 2,5% w /v) injiceret intravenøst. Dette farvestof er omkostningseffektivt og let tilgængeligt fra kommercielle kilder, men det har et bredere emissionsspektrum, der kan overlappe med RCaMP-emission og bløde igennem under erhvervelse af mikroskopbilled. Trin til spektral blanding er skitseret i afsnit 4 nedenfor for at omgå dette, men andre grønne farvestoffer med smallere emissionsspektre, såsom dem, der er baseret på EGFP, kan også anvendes.
Den nuværende metode giver detaljer om mus hale vene injektion med et kateter, to-foton mikroskop billede erhvervelse for dybde stakke, celle calcium signalering film, oprettelse af hæmodynamiske kymografer, og calcium og hæmodynamisk analyse med vores billedbehandling algoritmer17 (Figur 1). Der er flere fordele ved disse teknikker, der forbedrer in vivo imaging resultatet og reducere tid, ressourcer og dyr stress i løbet af sessionen. For det første giver brugen af et kateter til haleåreindsprøjtning mere kontrol over nålen, sprøjten og mængden af stof, der injiceres i musens cirkulation. Derudover forhindrer det farvestofindsprøjtning i halevævet, hvilket sparer dyre reagenser. For det andet bruger vi transgene mus, der udtrykker genetisk kodede calciumsensorer i ophedning af pericytter og demonstrerer, hvordan man lokaliserer dem i hjernens vaskulære netværk med en dybde z-stak, hvilket letter celleidentifikation og flytning i efterfølgende billeddannelsessessioner på lang sigt. Dette er en vigtig faktor i pericyte undersøgelser og sikrer korrekt celle klassificering6,7. For det tredje leverer vi vores parametre til indsamling af calciumfilm og hæmodynamiske linjescanningsdata, som er et godt udgangspunkt for måling af dynamiske cellulære signaler. Endelig præsenterer vi vores billedbehandlingsalgoritmer17, en omfattende billedbehandlingsværktøjskasse, der indeholder flere tilgange til billedforbehandling (såsom spektral unmixing), calciumbilledanalyse og hæmodynamisk analyse (diameter, hastighed osv.). Disse algoritmer kan generere plots til en hurtig og nem visualisering af dataene, samtidig med at det niveau af brugerekspertise, der kræves for at analysere resultaterne, minimeres. Desuden kan det automatiseres med et par linjer kode til hurtigt batch behandle flere datasæt med de samme parametre. Dette kan potentielt forbedre datavisualisering og forskeren.
Nøglen til at indsamle gode calcium imaging data er at justere laser magt og PMT indstillinger for klar fluorescens signal erhvervelse, men også at indsamle data med en tilstrækkelig billedhastighed til at fange hele calcium begivenhed. Dataene i denne protokol blev erhvervet med 10-11 billeder i sekundet, hvilket fanger de langsommere calciumsvingninger i ensheathing pericytter. Der er også flere trin under analysen, der kan forbedre analyseresultatet. For det første er spektral ub blanding gavnligt, hvis der er en betydelig overlapning mellem emissionsspektre af fluorophorer (Figur 2). Fluorescein-dextran blev brugt i denne protokol, fordi det er en omkostningseffektiv og kommercielt tilgængelig dextran konjugat, der er almindeligt anvendt til hæmodynamiske målinger5. Spektral ublandet hjælper med at rydde op i dataene til forbedret påvisning af calciumsignaler, men alternative fluorophorer med smallere emissionsspektre kan også bruges. For det andet er det nyttigt at vælge cellestrukturer som INVESTERINGSAFKAST (Figur 3) til klassificering af calciumhændelser i forskellige subcellulære områder, f.eks. Aktivitetsbaseret valg af investeringsafkast (figur 4)16 giver mere rumlig og tidsmæssig information om individuelle calciumhændelser. Dette kan være nyttigt, når du bestemmer hyppigheden af calciumhændelser i et givet område eller formering af begivenheder til andre cellulære områder. Brugen af programmeringssoftware til at analysere billeddata kan spare forskerne timer, når data batchbehandles, men det kræver en indledende tidsinvestering at justere parametrene for optimale resultater. De vigtigste faktorer er den forventede størrelse (i μm2) i det aktive område samt signalets varighed (minimum signaltid og maksimal signaltid skal defineres). Forskere skal undersøge nogle eksempel T-serie film først for bedst at afgøre, hvilke parametre der passer til deres data. Endelig kan data af dårlig kvalitet, der er indsamlet på mikroskopet, i høj grad hindre analysen af calcium og hæmodynamik (Figur 6). Derfor bør man passe på at optimere indstillingerne for anskaffelse af mikroskop i begyndelsen. Med disse faktorer i tankerne, denne protokol, der kan tilpasses til at passe calcium billeddannelse eller analyse af andre dynamiske cellulære signaler (f.eks fluorescerende natrium, kalium, metabolit, eller spænding udsving) i andre væv eller celletyper.
Der er flere begrænsninger i denne protokol. For det første indsamles dataene under anæstesi, hvilket påvirker hjernens aktivitet og kan påvirke blodgennemstrømningen. Lignende billeddannelse kan gøres i vågen mus, der er uddannet til at acceptere hovedfiksering for mere fysiologiske resultater. Derudover er det vigtigt at huske, at vi indsamler 2-dimensionelle billeder af en 3-dimensionel celle og blodkar in vivo. Derfor kan vi kun fange en fraktion af calciumhændelserne i disse celler eller blodgennemstrømningen i en enkelt del af blodkarret ad gangen.
En anden begrænsning at bemærke er, at to-foton calcium imaging er følsom over for bevægelse artefakter, hvor bevægelse ind og ud af brændpunktet flyet kan forveksles med calcium udsving. Denne protokol blev udført under anæstesi, hvilket begrænser dyrets bevægelse; bevægelsesartefakter kan dog introduceres ved musens vejrtrækningshastighed, puls, mulig vævs hævelse og i tilfælde af ophedning af pericytter, karsammentrækning eller vasomotion 4,6,18,19. Bevægelse artefakter kan afbødes af flere strategier. De billedbehandlingspakker, der bruges i denne protokol, omfatter et valgfrit bevægelseskorrektionstrin, som bruger et 2D-bøjningsprogram til at justere billederne i T-serien baseret på den synlige vaskulatur13,17. Rammer med væsentlige ændringer i fokusplanet identificeres af denne algoritme og kan udelukkes fra analyse. Derudover er det muligt at bruge statistiske strategier inden for billedbehandlingspakkerne, såsom en Z-score, når fluorescenssporene genereres, for at normalisere bevægelsen inducerede calciumudsving20. Den mest robuste tilgang til at tage højde for bevægelse artefakter i to-foton imaging er at kombinere udtryk for to fluorescerende indikatorer inden for samme celle, såsom en calcium indikator (f.eks GCaMP) og en fluorescerende reporter (f.eks mCherry), der er calcium-uafhængig. Udsving i fluorescerende reporter kan derefter tilskrives bevægelse og trækkes fra calcium indikator signal til at normalisere bevægelse artefakter.
Formålet med denne protokol er at give en klar forståelse af, hvordan man indsamler optimale calcium imaging og blodgennemstrømning data in vivo og at præsentere nye metoder og analyseværktøjer, som forskerne kan gennemføre for at forbedre deres resultater. Disse teknikker kan anvendes til at studere den rolle, forskellige pericytes populationer i blodgennemstrømningen kontrol eller i forskellige hjernesygdom stater. Disse billeddannelse parametre kan også bruges til at studere calcium og blodgennemstrømning i andre celletyper og organsystemer og lignende principper gælder for andre dynamiske billeddannelse teknikker, der er muliggjort af andre genetisk kodede sensorer, ud over calcium.
The authors have nothing to disclose.
J. Meza støttes af stipendier fra Mitacs og Research Manitoba. Finansiering af dette arbejde blev ydet af canadiske institutter for sundhedsforskning, Research Manitoba, Manitoba Medical Service Foundation, opstart finansiering fra University of Manitoba og Brain Canada gennem Canada Brain Research Fund, med økonomisk støtte fra Health Canada og Azrieli Foundation. De synspunkter, der kommer til udtryk heri, repræsenterer ikke nødvendigvis sundhedsministerens eller Canadas regerings synspunkter.
Acta2-RCaMP1.07 | The Jackson Laboratory | 28345 | In the video protocol the animal model used is a female mouse of 10 months, 1 day old. |
Applicators (Regular) | Bisco | X-80250P | |
BioFormats package for MATLAB | NA | NA | Denominated in this protocol as "image processing packages". Available in: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/ |
CHIPS MATLAB toolbox | NA | NA | Denomitaded in this protocol as "image processing algorithms". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: an Extensible Toolbox for Cellular and Hemodynamic Two-Photon Image Analysis. Neuroinformatics. 2018;16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Available in: https://github.com/EIN-lab/CHIPS |
Clear Ultrasound Gel, Medium viscosity | HealthCare Plus | UGC250 | |
Dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, neutral | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
Eye Lube Plus | Optixcare | NA | |
FIJI | Image J | NA | Denominated in this protocol as "image processor software". Available in: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
GCaMP6sfl/fl | The Jackson Laboratory | ||
Head Post fixing platform | University of Zurich | NA | |
Ketamine (Narketan 100 mg/mL) | Vetoquinol | 440893 | |
MATLAB R2020b | NA | Denominated in this protocol as "programming platform ". Available in: https://www.mathworks.com/downloads/ | |
Needle 0.3mmx25mm | BD PrecisionGlide | 305128 | |
Objective XLUMPLFLN20XW | Olympus | NA | https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/ |
PDGFRβ-CreERT2 | The Jackson Laboratory | 30201 | |
Polyethylene Tubing, PE10 I.D. 28mm (0.11”) O.D. 61mm (.024”) | BD Intramedic | 427401 | |
Prairie View | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
Ultima In Vitro Multiphoton Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | NA | https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html |
Under Tank Heater | Reptitherm U.T.H | E169064 | |
Xylazine (Rompun 20 mg/mL) | Bayer HealthCare | 2169592 |