活体转基因小鼠脑围产层钙和血液学成像

马尼托巴大学动物护理委员会批准了所有涉及实验动物的程序，该委员会由加拿大动物护理委员会管理。 1. 程序设置和准备 注：尾静脉导管注射需要以下物品：胰岛素注射器、15 厘米的 PE10 管、30 G 针头、纱布、盐水、钳子、绿色荧光素德克斯特兰染料、钳子和剪刀。此外，准备好一针氯胺酮/西拉津麻醉剂，将在成像会话前注射。 关键：第 1 步和第 2 步中的所有材料和设备在使用前必须用 70% 乙醇自动包装或冲洗进行消毒。如果钳子不能正确消毒，建议使用一对大针架。导管装配必须用钳子和钳子进行，以避免意外的针刺。 切割约15-20厘米的聚乙烯管，PE10（公元28毫米）：O.D. 61 毫米）。 将 27 G 胰岛素注射器填充 0.9% 的盐水，并将注射器的针头插入聚乙烯管的尖端。将盐水推过管子，确保没有泄漏。 使用钳子，来回弯曲 30 G 针（0.3 毫米 x 25 毫米），直到它从中心断裂。针必须干净，没有弯曲。 用钳子握住针头，小心地将针头插入附着在盐水填充注射器上的PE10管末端，并去除气泡。这是注射导管。 在注射前通过 13-25 μm 过滤器过滤 30 μL 的 2.5% （w/v） 荧光素 dextran。 用德克斯特兰的 30 μL aliquot 填充另一个胰岛素注射器，并确保填充的注射器中没有气泡。 2. 尾静脉注射 用异黄酮（4%感应，1.5%维护）或氯胺酮/西拉津（60毫克/千克;10毫克/千克;即p.）麻醉小鼠，并涂抹眼润滑剂凝胶。氯胺酮/西拉津建议在成像过程中进行更稳定的血流量测量，剂量可增加到90毫克/千克：10毫克/千克氯胺酮/西拉津，用于更长的成像过程。 当小鼠在麻醉的手术台上时，在尾巴上放一个装满温水的手套来拉皮横静脉。 30岁后取下手套，用乙醇清洁尾巴。 将尾巴放在拇指和中指之间。用食指在尾巴上施加压力以拉伸静脉。另一方面，拿起导管的针头，用钳子将挡板向上朝向天花板。 用 70% 乙醇清洁尾部后，以 0° 角将针头插入静脉，并通过导管轻轻注射盐水，以确保针头正确放置。注意：如果柱塞没有阻力，没有尾巴肿胀，那么针头就静脉了。如果有显著的阻力或肿胀，针头应去除。步骤 2.2-2.5 可以在尾部两侧重复多达 3 次，每秒钟试用一次导管末端的 30G 针头，直到放置正确。 针头静脉注射后，用含有荧光素德克斯特兰（第 1.6 步）的注射器在导管末端切换盐水注射器。慢慢地将德克斯特兰注入导管管中，确保导管不会冒泡。如果气泡明显，请切开含有气泡的管子将其取出并重新连接注射器。 注射所有脱氧酒（30 μL aliquot）后，取出注射器，用盐水注射器代替。将管子中剩余的德克斯特兰注射到鼠标中，直到管子中不留下任何染料。 从尾部取下针头，用纱布施加压力10-30s，直到出血停止。关键：如果经过6次尝试后，尾静脉注射不成功，动物应该在另一个会话中成像。此外，注入鼠标的总体积（盐水和德克斯特兰）不应超过 100 μL。 3. 两次光子显微镜 聚焦颅窗注：在数据采集过程中使用氯胺酮/西拉津麻醉，因为它的血管效应（血管吸附）比异黄酮小。如果在上述步骤中使用异黄酮，请在成像前给小鼠注射氯胺酮/西拉津（建议剂量上述）。 用螺丝将鼠标通过头柱固定到显微镜下带有加热垫的平台上。 将眼润滑剂涂抹在鼠标的眼睛上。 用潮湿的牙科施用器清洁颅窗。确保没有粒子会干扰成像过程。 在窗口上涂抹超声波凝胶。 通过双光子显微镜目标聚焦，直到在窗口下可以看到皮亚血管。 检查鼠标的呼吸，并确保加热垫提供足够的温度支持。 图像采集注：本实验中使用的双光子显微镜具有可调谐的Ti-蓝宝石激光器，用于荧光激发，其波克尔细胞控制着到达样品的激光量。发射光由 565 长通二色分割成两个 GaAsP 光电图管 （PMT），带 595/50 频段通过滤镜（红色）和 525/70 频段通过滤镜（绿色）用于检测。步骤 3.2 到 3.4 中描述的程序使用本协议中的双光子显微镜的特定软件执行（参见 材料表）。这些步骤可以适应其他显微镜软件和设备。 在关闭房间灯后，将显微镜软件中所需的波长设置为 990 nm，通过单击 2P 激光 盒来激发 RCaMP 和荧光素-德克斯特兰。 通过单击 电源/增益 盒/激光 部分，将 Pockels 1 电池电压调整为 30%或 300 值（比例为 1000）来设置激光功率。在此设置下到达样品的激光功率以前被确定为 ±30mW。 通过单击 电源/增益 盒/PMT 部分并将值调整为 700-800 来设置 PMT 探测器的灵敏度。注：这些值可以相对于荧光样品的强度进行调整，在打开房间的灯之前应设置为零。 进入 “图像分辨率” 部分，单击 512 x 512 分辨率以获得更大的图像大小。 单击 2P 激光/打开 以打开 2P 激光快门。 前往 扫描部分 并单击 实时扫描 按钮。注：通过这些参数和更高分辨率进行实时扫描，可以看到 RCaMP 阳性壁画细胞和荧光标记的血浆。如果信号较弱，则在图像清晰之前，可以增加 pockel 值。关键：在表面组织层中，激光功率不应超过 50 mW，在本示例中的 Pockels 细胞设置中，激光功率约为 600。 获取壁画细胞和血管网络的深度堆栈注：建议获取深度堆栈，以正确定位血管网络中的围板。穿刺围板位于从穿透动脉7，8，9的第一到第四分支。本协议中使用的显微镜软件将深度堆栈称为”Z 系列”。 移动X、Y和Z平面的显微镜目标，根据RCaMP的平滑肌肉细胞标记，将大脑表面的大动脉定位。 单击 Z 系列 框。 聚焦在皮亚尔容器附近的组织顶部，通过单击当前 Z 系列 /开始位置 [μm] 部分，将此设置为 Z 系列堆栈的零点和顶部。单击顶部有四条黑色条纹和一条红色条纹的框。 通过单击 当前 Z 系列/停止位置 [μm] 部分，将组织内的焦点向下到所需的深度，并将此设置为堆栈的底部。单击底部有四条黑色条纹和一条红色条纹的框。 通过在”步幅大小”按钮下方的框中键入所需的值（步幅大小按钮在Z 系列/当前 Z 系列部分中进行本地化），将每个图像平面的厚度（步幅大小）设置为 1-2 μm。这将定义在堆栈中获取的图片数量。 通过单击激光 /PMT 补偿 框并选择 相对（指数梯度），设置激光功率，随着显微镜在堆栈中移动的深度，激光功率呈指数级增长。 命名文件，选择一个文件夹来保存它，并点击 开始Z系列。 收购后，在成像处理软件中打开 Z 系列。 将两个通道合并为彩色图像，并通过点击框 “图像|扫描”以查找感兴趣的围带和血管颜色|拆分通道;图像|颜色|合并通道。 选择包含围网体 的兴趣区域 （ROI），并保存位置，以帮助在未来的成像会话中再次定位这些点。 T 系列钙成像电影采集（时间） 使用从上面的深度堆栈和ROI作为参考，在实时扫描模式下移动X、Y和Z轴中的显微镜目标，直到找到感兴趣的围网。 要收集腹膜钙事件的电影，请通过访问 图像分辨率 部分并单击 128×128 框来提高获取帧速率（每秒 10 帧>） 。 通过单击 T 系列 框并输入持续时间框中的时间，将成像持续时间设置为 60s。 在 “保存路径” 框旁边，单击 带有三个点的按钮 ，以使用唯一的文件名称更新保存路径。 在容器上进行光学缩放，以考虑较低的分辨率，并通过调整 光学变焦 [mag] 部分的值来更近距离地查看近地层。 点击启动T系列获取 T系列。 血液动力学测量与 kymograph （线扫描） 在实时扫描模式下，以512 x 512像素分辨率聚焦感兴趣的容器。 要测量血管直径和红血球速度，请单击 线扫描 ，使用显微镜开始一维扫描。 将扫描时间（30-60 秒）设置为毫秒。 画一条线，将感兴趣的容器分割开来，沿着容器平行移动。这将生成左侧血管直径的基姆图和通过右侧血管的红血球条纹。注：只要血管处于同一成像平面，就可以用相同的线进行测量。 命名文件并单击 “开始线”以 获取数据。 4. 图像分析 钙电影分析。注：此协议概述了光谱未混合的步骤 （图2） 和两种不同的方法来分析包壳围产层钙事件使用手动，手工选择的ROI （图3） 和基于活动的自动投资回报率选择 （图4)16,17.为了检测和分类信号峰值与从每个投资回报率的规范化钙跟踪，数据是长通和带通过过滤，这有助于平滑数据的振幅和宽度估计，也识别不同形状的峰值：单峰，多峰和高原（图 3B).此分析的参数可以优化以检测不同类型的动态蜂窝信号。下面的步骤将需要使用图像处理软件和编程软件与图像处理包包含不同的代码来分析上述钙电影。请参阅材料表，了解此协议中使用的程序和包的完整列表。可以导入不同类型显微镜的成像数据，这些封装可维护图像中的元数据。注：步骤 4.1.1-4.1.7 描述了如何在手动图像处理软件中选择 ROI，以便随后在手动钙分析方法中使用（第 4.1.16 步）将.xml文件拖到软件工具栏，在图像处理软件中加载钙成像 T 系列。单击 “确定” 框。 以堆栈的平均值为例（堆栈的平均值被图像处理软件标记为”Z 投影”）。这可以通过单击图像|来完成 堆栈| 工具栏中的 Z 投影。 从两个通道制作彩色图像，如第 3.3.9 步。 点击框中分析|，打开 ROI 管理器窗口 工具|投资回报率经理，或只是按字母”T”在键盘上。 通过单击图像处理软件工具栏上的 多边形形状 来选择多边形工具，并勾勒出可见的包裹围城结构，如 soma 和工艺。 单击位于 ROI 管理器窗口中的 “添加 “按钮，在 ROI 管理器中添加选定的 ROI。 单击 “重命名” 按钮，为每个感兴趣的区域提供一个独特的名称，并将它们保存为拉链文件夹，稍后可以通过单击 More 在编程软件中加载 >> |保存。注：步骤 4.1.8-4.1.14 描述了如何将钙 T 系列导入编程平台，以及如何将显微镜 PMT 检测到的不同荧光素解混合到不同的通道中（图 2）。 打开编程软件，确保图像处理包的文件夹在路径上（参见 材料表）。 通过在编程平台命令窗口中调用 BioFormats 功能将钙 T 系列导入编程软件，该窗口会自动打开文件选择窗口。 通过输入所需的数字来定义每个通道上的内容。在此示例数据中，第 1 频道回答=6（cellular_signal）、第 2 频道答案=1（blood_plasma）。 将数据绘制为编程软件中的电影，通过调用 绘图 功能来促进可视化。 要去除渗入红色 RCaMP 通道的荧光素-德克斯特兰的绿色荧光，请通过调用编程平台命令窗口中的 unmix_chs 功能来解密图像处理包中的通道。 选择仅包含第 1 频道此荧光荧光的区域，例如此情况下的 RCaMP。 选择仅包含荧光 2 中的荧光的区域，例如此示例中的血浆中的荧光素。 选择一个没有荧光的背景区域。这将生成一个光谱贡献矩阵，该矩阵应用于每个通道中的每个像素。它显著改善了 RCAMP 信号的本地化，这将增强这些结构中的钙事件检测。注：如上所述，在图像处理包中可以分析钙成像数据的方法有很多种。步骤 4.1.16-4.1.23 描述了使用手动选择的 ROI 分析包壳围层钙事件的方法。 通过在编程平台命令窗口中调用 CellScan 功能，对未混合的钙膜进行细胞信号分析。 代码会询问”您想使用哪种 ROI 检测方法？键入 数字 2 将手选 ROI 加载到编程平台。 从拉链文件夹中加载较早前从围网中手工选择的感兴趣区域（步骤 4.1.6）。 代码会问”规模因素是什么？确定手选 ROI 相对于所分析的图像系列的刻度因子，并键入刻度数。在此示例中，比例因子为 1，因为 ROI 不需要调整大小，因为它们是在具有 128×128 像素的图像上选择的，其分辨率与原始钙电影相同。 通过调用命令窗口中的流程和图示功能，生成每个 ROI 的图图和不同颜色的规范化钙痕迹 （图 3A）。 如果代码未检测到单个痕迹中的大多数钙事件，则通过调用 opt_config 函数并调整值来修改配置优化框中的内置参数，例如将短途过滤数据的阈值降低到基线周期标准偏差的三倍，这是 T 系列的前 30 帧。 选择优化框中的 “过程 “按钮以应用新参数。注：为了检测和分类信号，规范化的钙痕迹是长通和带通过滤，这有助于平滑数据的振幅和宽度估计，但也确定信号是单峰，多峰或高原（图3B）。 将数据输出为.csv文件，其中包含有关感兴趣区域的空间信息以及通过调用命令窗口中的 output_data 函数来识别的峰值。给文件一个独特的名称，以便在统计程序中进一步分析。注：步骤 4.1.24-4.1.31 描述了使用基于活动的投资回报率分析分析包膜围层钙事件的方法。 重复步骤 4.1.8.-4.1.16 导入钙电影，拆解通道，并在编程平台中调用 CellScan 功能。 代码会询问”您想使用哪种 ROI 检测方法？键入 数字 6， 根据 3 维（x、y 和时间）的荧光活动和变化选择自动兴趣识别区域：”3D FLIKA 算法”）。 通过调用命令窗口中的进程和绘图功能，绘制处理结果，将已确定的兴趣区域视为不同的颜色。每个投资回报率在时间和空间上都非常出色，并作为叠加面膜表示（图4）。 如果算法无法检测到眼睛清晰可见的 ROI，请通过调用 opt_config 函数并调整值来修改优化框内的内置参数，例如增加及时平滑数据的高斯过滤器（2 s），将查找 ROI 的阈值降低到基线标准偏差的 3 倍。 选择优化框中的进程按钮以应用新参数。随着优化过程，应识别更多的投资回报率（图4B）。 将 ROI 绘制为电影，通过将 默认 框的模式更改为优化窗口内 的电影 ，以清晰识别活动区域（以彩虹色勾勒）以进一步可视化。 通过在命令窗口中调用 output_data 功能，将数据输出为 csv 文件。此文件可以在统计程序中进一步分析。注：分析参数可以调整以适应任何类型的动态细胞信号（钙、FRET 比率等）。以上所有步骤都可以使用简单的编程代码实现自动化，以便用相同的设置批量处理许多钙电影。 线扫描血流量分析。 将第 3.5 节中获取的线扫描 kymograph 数据文件导入编程软件。 代码会问”频道 1 和 2 显示的内容？在提示时定义每个通道上的内容。在此示例中，通道 1 是空白（类型 0），通道 2 是blood_plasma（类型 1）。 通过调用 LineScanDiam 功能来运行线路扫描中的直径分析功能，该函数打开一个框来选择与 kymograph 中的直径对应的区域（图 5B，左图）。 在与容器直径相对应的基姆图荧光边界外绘制一个框。 通过调用过程函数来处理此数据类，以测量容器直径最大半宽度，并生成具有绘图函数的图 （图 5C）。 通过在命令窗口中调用 output_data 功能，将数据输出为 csv 文件。此文件可以在统计程序中进一步分析。 通过调用 LineScanVel 功能来运行速度 radon 转换分析，该函数打开一个框来选择 kymograph 中对应 RBC 速度的区域（图 5B，右图）。 在与船速相对应的基姆图荧光边界内绘制一个框。 通过调用过程函数来处理此数据类，以便从荧光条纹的角度计算红血球的速度、通量和线性密度。生成具有绘图函数的绘图（图 5D）。 通过在命令窗口中调用 output_data 功能，将数据输出为 csv 文件。此文件可以在统计程序中进一步分析。注：基姆图必须在黑色空间之间具有清晰的荧光和清晰的边缘，以便直径和速度分析准确（图5A，B）。以精确的方式绘制正交线和平行线非常重要，否则将不可能对基姆图进行可靠的分析。与图像处理算法的钙分析类似，可以优化直径和速度计算的参数。