Quantitative <sup>31</sup>P NMR Analysis of Lignins and Tannins

Dimitris  S. Argyropoulos; Nicol&#242; Pajer; Claudia Crestini

doi:10.3791/62696

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Química

Quantitative ³¹P NMR Analyse von Ligninen und Tanninen

Published: August 02, 2021

doi:

10.3791/62696

Dimitris S. Argyropoulos², Nicolò Pajer¹, Claudia Crestini¹

¹Department of Molecular Sciences and Nanosystems,Ca’ Foscari University of Venezia, ²Departments of Chemistry and Forest Biomaterials,North Carolina State University

Summary

³¹ P NMR ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur strukturellen Aufklärung von Polyphenolen. Dieses schnelle, einfache, präzise, quantitative und hochreproduzierbare Analyseverfahren, das die Quantifizierung und Differenzierung der verschiedenen Arten von Hydroxy-, Phenol- und Carbongruppen in Ligninen und Tanninen ermöglicht, ist mittlerweile zu einem routinemäßigen Analysewerkzeug geworden.

Abstract

Die Entwicklung nachhaltiger Bioraffinerieprodukte steht unter anderem vor der Herausforderung der Lignin- und Tanninverwertung. Diese reichlich vorhandenen, erneuerbaren aromatischen Biopolymere wurden aufgrund ihrer inhärenten strukturellen Komplexität und ihres hohen Grades an Variabilität und Artenvielfalt nicht weit verbreitet. Das Fehlen einer definierten Primärstruktur für diese Polyphenole wird durch komplexe chemische Veränderungen, die während der Verarbeitung induziert werden, noch verstärkt, was schließlich eine Vielzahl von strukturellen Merkmalen von extremer Bedeutung für weitere Verwertungsbemühungen verleiht.

Folglich ist ein Protokoll zur schnellen, einfachen und eindeutigen Identifizierung und Quantifizierung der verschiedenen funktionellen Gruppen, die in natürlichen Polyphenolen vorhanden sind, eine grundlegende Voraussetzung für das Verständnis und die entsprechende Anpassung ihrer Reaktivität und ihres eventuellen Nutzens.

Quantitative ³¹P NMR bietet die Möglichkeit, unsubstituierte, o-mono substituierte und o-disubstituierte Phenole, aliphatische OHs und Carbonsäure-Anteile in Ligninen und Tanninen mit breitem Anwendungspotenzial schnell und zuverlässig zu identifizieren.

Die Methodik besteht aus einem quantitativen Lignin- oder Tannin-Markierungsverfahren in situ unter Verwendung einer geeigneten ^{31 P-haltigen Sonde,}gefolgt von der Erfassung eines quantitativen ³¹P NMR-Spektrums in Gegenwart eines internen Standards. Die hohe natürliche Häufigkeit des ³¹P-Kerns ermöglicht kleine Mengen der Probe (~30 mg) und kurze NMR-Erfassungszeiten (~30-120 min) mit gut aufgelösten ³¹P-Signalen, die stark von der umgebenden chemischen Umgebung der markierten OH-Gruppen abhängen.

Introduction

Dieses Verfahren, das kürzlich in Nature Protocols¹ veröffentlicht wurde, wurde in der Archivliteratur über 3.000 Mal zitiert und ist zu einer Routinemessung für die Lignin- und Tannincharakterisierung geworden, da es wesentliche, schnelle und reproduzierbare Strukturinformationen liefert.

Lignin und Tannine
Als green chemistry von Paul T. Anastas und John C. Werner²^,³eingeführt wurde, veränderte es die allgemeine Auffassung der Chemie drastisch. Insbesondere wird die Bedeutung des Einsatzes nachhaltiger Materialien anstelle fossiler Rohstoffe wie Öl und Kohle als Ausgangspunkt als entscheidender Aspekt hervorgehoben²^,³. Unter den verschiedenen Arten von Biomasse ist Lignin das am häufigsten vorkommende aromatische Biopolymer und kann als potenzielle Quelle für Industrierohstoffe und Produkte mit hoher Wertschöpfung angesehen werden⁴.

Lignin ist der zweithäufigste Holzbestandteil (mit Cellulose an erster Stelle und Hemicellulose an dritter Stelle). Sein Gehalt in Pflanzen variiert je nach Pflanzentyp: zum Beispiel Laubhölzer, die sich durch eine geringere Menge an Lignin im Vergleich zu Nadelhölzern auszeichnen (20% ± 4% vs. 28% ± 4%). Darüber hinaus ist die Ligninverteilung im pflanzlichen Gewebe nicht homogen: Der höhere Ligningehalt findet sich in der Zellwand⁵^,⁶. Lignin ist ein polyphenolisches Material, das industriell als Nebenprodukt der Papier-/Zelluloseindustrie gewonnen wird^7. Es wird aus dem Holzaufschlussverfahren zurückgewonnen, bei dem Hackschnitzel hauptsächlich in Gegenwart von^OH- und/oder^OH-+ HS-Ionenbedingungen verarbeitet werden, um Cellulose von Hemicellulose und Lignin (Soda- und/oder Kraftverfahren) zu trennen⁸^,⁹.

Die ersten Versuche, Lignin zu untersuchen, wurden von Payen bzw. Schultze in den Jahren 1838 und 1865 unternommen¹⁰. 1977 fasste Adler alle relevanten verfügbaren Erkenntnisse dieser Zeit^{zusammen 11}. Es ist derzeit anerkannt, dass die Ligninbausteine drei Phenylpropanoid-Einheiten sind: p-Cumarin-, Coniferyl- und Sinapylalkohole. Diese Monomere führen dank eines Polymerisationsprozesses freier Radikale zu p-Hydroxyphenyl-, Guaiacyl- und Sinapyleinheiten, die schließlich im Großen und Ganzen Lignin bilden (Abbildung 1)¹². Das Fehlen einer Primärstruktur in Ligninen impliziert eine inhärente Schwierigkeit für seine strukturelle Charakterisierung. Dementsprechend war die Bewertung der Verteilung des Molekulargewichts schon immer etwas umstritten. Gemahlenes Holzligngnin, das unter milden Bedingungen isolierte Lignin, das sich meist Protolignin¹⁰annähert, besteht aus Oligomeren^13, die über supramolekulare Aggregationsprozesse in hohem Maße interagieren¹⁴^,¹⁵.

Abbildung 1: Ein repräsentatives Modell von Nadelholz-Lignin, in dem die verschiedenen Arten von Bindungen hervorgehoben sind.

Lignine werden üblicherweise klassifiziert in Abhängigkeit von: (a) der Holzart, aus der sie gewonnen werden (z. B. Hart- und Nadelholz), (b) dem Verfahren, mit dem es isoliert wird. Die wichtigsten industriellen Lignintypen sind Kraft, Lignosulfonate und Organosolv.

Die Struktur von Lignin hängt stark von seiner Herkunft und Verarbeitungschemie ab. Genauer gesagt, wenn die ziemlich komplexe und unregelmäßige Struktur von Lignin mit seiner natürlichen Vielfalt und den komplexen Verarbeitungschemikalien zusammengesetzt wird, entsteht ein Material von extremer Variabilität, Diversität und Heterogenität, das seine Verwendung auf geringwertige Anwendungen beschränkt¹⁶. Während Nadelholzligningne hauptsächlich Guaiacyleinheiten (G) mit vernachlässigbaren Mengen an p-Hydroxyphenylgruppen (G-Lignin) enthalten, bestehen Hartholzligningne aus Guaiacyl- und Syringyl-Untereinheiten (GS-Lignin) in unterschiedlichen Verhältnissen und Grasligningnen bestehen aus Guaiacyl-, Syringyl- und p-Hydroxyphenyl(GSH-Lignin)-Untereinheiten. Der zur Isolierung verwendete extraktive Ansatz beeinflusst dramatisch die Struktur des entstehenden Lignins¹⁷. Abbildung 2 zeigt drei Ligninstrukturen, die sich durch den verwendeten Isolationsansatz unterscheiden. Einige Überlegungen zur Wirkung der Extraktionsmethode könnten hervorgehoben werden. Erstens ist Kraft-Lignin ein dealkyliertes, stark fragmentiertes und kondensiertes Lignin, während Organosolv-Lignin eine ähnliche Struktur wie gemahlenes Holz-Lignin aufweist (isoliert nach dem Bjorkman-Ansatz)¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Schließlich zeichnen sich Lignosulfonate durch einen hohen Sulfonierungsgrad aus, abhängig von der Intensität und den Bedingungen des extraktiven Sulfonierungsprozesses.

Abbildung 2: Repräsentative Strukturen für technische Lignine. In dieser Abbildung sind die Unterschiede zwischen den verschiedenen Ligninarten zu sehen. (A) Weichholz Kraft Lignin ist stark kondensiert, (B) Lignosulfonate sind durch Sulfongruppen auf gesättigten Kohlenstoffen gekennzeichnet, und (C) Organosolv Lignin hat eine ähnliche Struktur wie gemahlenes Holz lignin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ähnlich wie Ligninine sind Tannine polyphenolische Verbindungen, die in Pflanzen vorkommen. Eine kürzlich erschienene und aktualisierte Übersicht über die extraktiven Ansätze und Anwendungen von Tanninen wurde kürzlich von Das et al.²¹veröffentlicht. Die Bedeutung von Tanninen im Alltag kann anhand von zwei Beispielen hervorgehoben werden: Sie verleihen Weinen Geschmack und Farbe²²; darüber hinaus bietet ihre polyphenolische Struktur antioxidative Eigenschaften und macht sie ideal für den Einsatz in der Gerbindustrie²³. Tannine werden in zwei Klassen unterteilt: hydrolysierbar und nicht hydrolysierbar. Hydrolysierbare Tannine können als Polymer aus gallischen, digallischen und ellagischen Säureestern betrachtet werden (Abbildung 3). Diese Ester entstehen durch die Veresterung der Phenolsäuren mit Zuckermolekülen (z.B. Glucose, Rhamnose und Arabinose).

Abbildung 3: Typische hydrolysierbare Tannine: Gerbsäure, Vescalgin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Nicht hydrolysierbare Tannine, auch kondensierte Tannine genannt, sind Polymere und Oligomere, die aus Flavan-3-olen stammen. Unter den Flavan-3-ols sind Catechine und Gallocatechin am häufigsten. Sie sind farblose kristalline Verbindungen (Abbildung 4). Durch die Polymerisation entsteht ein Polymer, das sich durch eine helicoidale Struktur auszeichnet. Die aromatischen Hydroxygruppen sind auf die Außenseite der Helix gerichtet, während sich die Pyransauerstoffe im Inneren befinden.

Abbildung 4: Proantocyanidin-Strukturen: R = H, OH, OCH₃. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Charakterisierung von Ligninen und Tanninen mittels NMR
Zwei Arten von Informationen sind für die Charakterisierung von Lignin oder Tannin entscheidend: (a) chemische Struktur (z. B. Hydroxygruppengehalt, Art und Häufigkeit von Interunit-Verknüpfungen) und (b) Molekulargewicht und Polydispersität. Seit den frühen Studien zu Lignin wurden verschiedene Techniken eingesetzt, um diese Ziele zu erreichen, und es haben sich zwei Klassen von Methoden herausgebildet: chemische und physikalische Methoden.

In der Ligninchemie wurden chemische Methoden, wie alkalische Nitrobenzoloxidation, Derivatisierung gefolgt von reduktiver Spaltung, Permanganatoxidation und Thioacidolyse, historisch weit verbreitet²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹. Doch auch wenn die analytischen Protokolle implementiert und optimiert wurden, sind sie zeitaufwändig, mühsam und erfordern umfangreiche experimentelle Fähigkeiten³⁰. Alternativ wurden von Beginn der instrumentellen Analyse an physikalische Methoden verwendet, um Lignin- und Tannincharakterisierungen durchzuführen³¹. Diese Techniken ermöglichen es, die Probleme klassischer Methoden zu überwinden, wodurch die Ligninstruktur leicht charakterisiert werden kann.

Die Kernspinresonanz (NMR) ermöglicht es, Informationen über die Ligninstruktur und die chemische Zusammensetzung zwischen den instrumentellen Techniken zu erhalten. Insbesondere Daten aus quantitativen monodimensionalen 1 H NMR-Spektren und quantitativen 13 C NMR-Spektren können Aufschluss über verschiedene Arten von Lignin-Interunit-Bindungen^{geben 32}^,³³^,³⁴^,³⁵. Leider leiden eindimensionale Spektren unter Signalüberlappungen, die die Bemühungen um Signalintegration ernsthaft untergraben können. Quantitative Versionen von HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), Q-HSQC (Quantitative – Heteronuclear Single Quantum Coherence), wurden verwendet, um die Ligninstruktur besser zu verstehen und hilfreiche Informationen über interne Verbindungen zu liefern. Sie können jedoch nicht vollständig genutzt werden, um die verschiedenen Gebäudeeinheiten¹³^,³⁶^,³⁷ quantitativ zu bestimmen.

Um die mit der ein- und zweidimensionalen NMR verbundenen Probleme zu lösen, wurde eine Substratderivatisierung in Betracht gezogen. Zu den Vorteilen dieses Ansatzes gehört, dass spezifische Markierungen innerhalb des komplexen Makromoleküls eingeführt werden können und keine spektrale Interferenz durch das Lösungsmittel entsteht, in dem die markierten Substrate gelöst sind¹. Verkade war der Pionier auf diesem Gebiet und führte eine 31-P-NMR-Analyse von Phosphorderivaten, Kohlederivaten und verwandten Verbindungen^{durch 38}. In der Veröffentlichung wurde ein Screening verschiedener phosphorhaltiger Reagenzien (Phospholane) durchgeführt und die chemische Verschiebung anderer markierter Verbindungen aufgezeichnet. Argyropoulos’ Team führte erstmals 1991 die Derivatisierung für die quantitative und qualitative Analyse von Hydroxygruppen in Ligninein. Nach der Untersuchung der Derivatisierung von Lignin-Modellverbindungen mit phosphorhaltigen Reagenzien ebnete seine Gruppe den Weg für eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Ligninchemie, ^{die 31}P NMR-Analyse³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³. Unter den verschiedenen untersuchten Phospholanen kam Argyropoulos zur Verwendung von 2-Chlor-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholan (TMDP) als am besten geeignet für die Durchführung der Ligninanalyse⁴⁴. TMDP reagiert selektiv mit Hydroxygruppen, die die quantitative Bildung von phosphorhaltigen Derivaten verursachen, die durch spezifische chemische Verschiebungen der ³¹P NMR gekennzeichnet sind (Abbildung 5).

Abbildung 5: Lignin- und Tanninphosphytilationschemie. Die Markierung von Lignin- und Tannin labilen H-Gruppen erfolgt durch In-situ-Reaktion. Die markierten Polyphenole zeichnen sich durch spezifische ³¹P NMR-Banden aus, die den verschiedenen Arten von Hydroxygruppen entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Probenderivatisierung erfolgt in einem Pyridin/Chloroform (1,6:1)-Gemisch; diese Wahl ergibt sich aus einer genauen Bewertung. Pyridin hat zwei Vorteile. Erstens vereinfacht und verstärkt die Auswahl eines Lösungsmittels, das durch einen Hildebrand-Parameter von etwa 22,1 MPa^1/2 gekennzeichnet ist, die Lignin-Solubilisierung⁴⁵. Folglich ist die Zugabe von Pyridin als Lösungsmittel, dessen Hildebrand-Parameter 21,7 entspricht, somit optimal. Zweitens geht die Reaktion von TMDP mit Hydroxygruppen mit der Bildung von Salzsäure (HCl) als Nebenprodukt mit begleitenden negativen Auswirkungen auf die einfache Bildung von Lignin-Phospholan-Derivaten einher. Aus diesem Grund muss die resultierende HCl neutralisiert werden. Bei signifikantem Überschuss ermöglicht die Basisalität des Pyridins im Verhältnis zu TMDP die Neutralisierung des HCl (durch die Bildung von Pyridinhydrochlorid).

Die Verwendung des empfohlenen Pyridin/deuterierten Chloroform-Binärlösungsmittelsystems basiert auf drei Gründen. Erstens begünstigt es die Probenauflösung. Zweitens, da Pyridinhydrochlorid in Chloroform löslich ist, kann es Ausfällung und Verschlechterung des endlichen Spektrums verhindern. Drittens wird deuteriertes Chloroform aufgrund seines einzigartigen Singuling-Signals ausgewählt, das eine Verriegelung des NMR-Spektrometers während des Erfassungsprozesses ermöglicht. Die Probenderivatisierung erfolgt in Gegenwart eines internen Standards. Auf diese Weise, wenn die Probe und der Standard derivatisiert werden, ermöglicht der Vergleich der Integrale der Peaks der Probe und des Standards die Quantifizierung der Menge für jede Art von Hydroxygruppe. Verschiedene Verbindungen wurden als interne Standards betrachtet. Diese Verbindungen zeichnen sich durch eine einzige Hydroxygruppe pro Molekül aus, die nach der Derivatisierung ein einziges scharfes Signal im ³¹P NMR-Spektrum bietet. Die Auswahl der Norm muss sorgfältig getroffen werden. Sein Signal sollte sich nicht mit dem der derivatisierten Probe überlappen. Cholesterin war in den frühen Tagen weit verbreitet. Eine teilweise Überlappung mit Signalen, die sich aus der aliphatischen Hydroxygruppe ergeben, schränkt jedoch ihre Verwendung ein. Für die Routineanalytik werden interne Standardlösungen von N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (NHND) bevorzugt. Aufgrund der NHND-Instabilität können seine Standardlösungen jedoch nur für wenige Tage gelagert werden⁴⁶.

Protocol

Das folgende Flussdiagramm (Abbildung 6) beschreibt das gesamte experimentelle Protokoll zur Durchführung einer 31P NMR-Analyse von Ligninen und Tanninen. Abbildung 6: Verfahren für die 31P NMR-Analyse von Ligninen und Tanninen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 1. Probenvorbehandlung Trocknen Sie ein Aliquot (ca. 100 mg) des Analyten (Lignin- oder Tanninprobe) über Nacht in einem auf 40 °C eingestellten Vakuumofen.HINWEIS: Besondere Aufmerksamkeit ist bei der Temperaturauswahl erforderlich, da Temperaturen über 40 °C die empfindliche Struktur der untersuchten Polyphenole chemisch verändern können. Nach dem Trocknen die Probe schnell in einen wasserfreien Calciumsulfat-Austrocknungser überführen, bis sie Raumtemperatur erreicht. Dieser Schritt ist obligatorisch, um zu vermeiden, dass die Probe Feuchtigkeit aus der Umgebung aufnimmt. 2. Zubereitung von Lösungsmittellösungen Ein Pyridin/deuteriertes Chloroform-Lösungsmittelgemisch wird in einer 20-ml-Probendurchstechflasche durch Mischen von wasserfreiem Pyridin und deuteriertem Chloroform in einem Verhältnis von 1,6/1 (v/v) zubereitet.VORSICHT: Achten Sie bei der Manipulation von Pyridin und deuteriertem Chloroform. Diese Verbindungen sind brennbar, schädlich und giftig. Bereiten Sie die Lösung vor und verwenden Sie sie in einem gut belüfteten Abzug mit geeigneten Handschuhen. Fügen Sie 5-8 g gut gewaschene und getrocknete aktivierte 5A-Molekularsiebe in 3,2 mm Pellets hinzu, um Wasserspuren zu entfernen. Darüber hinaus wird die Verwendung einer Septumkappe dringend empfohlen, um Luftkontakt und Feuchtigkeitskontamination des Lösungsmittelsystems zu verhindern. Lagern Sie die vorbereitete Lösung im Dunkeln. 3. Interne Standardlösung (IS) Vorbereitung In einem 2-ml-Erlenmeyerkolben wird eine 0,1-m-Lösung aus Chrom(III)-acetylacetonat (etwa 10 mg) und internem Standard (etwa 35,8 mg NHND oder 77,3 mg Cholesterin) in der zuvor hergestellten Lösungsmittellösung hergestellt.ACHTUNG: Chrom (III) Acetylacetonat ist schädlich; Tragen Sie während der Manipulation geeignete Handschuhe. Notieren Sie das genaue Gewicht des IS, das in der IS-Lösung hinzugefügt wurde. Die IS-Lösung wird in eine Durchstechflasche mit einer versiegelten Kappe mit aktivierten Molekularsieben (siehe Nummer 2.2) überführen und im Dunkeln bei 40 °C lagern. 4. NMR-Probenlösungsvorbereitung Wiegen Sie genau ~ 30 mg der Probe in einer 2-ml-Durchstechflasche, die mit einem Rührstab ausgestattet ist. Verschließen Sie die Durchstechflasche mit einer Septumkappe. 0,5 ml der Lösungsmittelsystemlösung werden in die Durchstechflasche mit der Probe geben. 100 μL der IS-Lösung werden über eine Mikropipette in die Probendurchstechflasche übertragen. Die resultierende Dispersion (500 U/min) magnetisch umrühren, bis das gesamte Lignin oder tannin gelöst ist, was zu einer klaren Lösung führt.HINWEIS: Da eine vollständige Probenlösung unerlässlich ist, kann dieser Schritt bis zu 12 Stunden dauern. 0,1 ml TMDP werden in die Probenlösung übertragen. Legen Sie die Probe unter kräftiges magnetisches Rühren. Halten Sie die Probenlösung verschlossen. Verwenden Sie TMDP in einem gut belüfteten Abzug, während Sie geeignete Handschuhe tragen.ACHTUNG: TMDP und seine Dämpfe sind korrosiv, schädlich und interagieren schnell mit Wasser.HINWEIS: Die Bildung eines gelben Niederschlags ist auf Wasserspuren in der Probe oder der Pyridin/Chloroform-Lösung zurückzuführen. In einem solchen Fall muss der Vorgang wiederholt werden, indem sichergestellt wird, dass alle möglichen Feuchtigkeitskontaminationen vermieden werden. Die Probenlösung wird mit einer Pasteur-Pipette in ein NMR-Röhrchen gegeben. 5. NMR-Analyse Laden Sie das Rohr in das NMR-Instrument. Das Spektrometer, mit dem diese Analyse durchgeführt wird, benötigt eine Breitbandsonde. Korrigieren Sie die experimentellen Parameter gemäß der einstellung in Tabelle 11. PULSE PROGRAMM Inverser gated entkoppelter Impuls (zgig) NUKLEÖS 31P SPEKTRALE BREITE 100 S.P.m. ERFASSUNGSZEIT – 0,8 s ENTSPANNUNGSVERZÖGERUNG ≥ 10 s SCANS-NUMMER 64 oder mehr SPEKTRUM ZENTRUM 140 S.P.m. Tabelle 1: Experimentelle Parameter zur Aufzeichnung von 31P NMR-Spektren von derivatisierten Ligninen oder Tanninen. Stellen Sie die Spektrometerfrequenz mit der Resonanzfrequenz von deuteriertem Chloroform ein, shim die Probe und stimmen Sie das Spektrometer ab. Starten Sie dann die Akquisition. 6. Spektrumverarbeitung und -analyse Verarbeiten Sie 31P NMR Rohdaten durch eine geeignete Standardsoftware nach den folgenden Schritten. Führen Sie eine Fourier-Transformation durch. Phase durch manuelle Phasenkorrektur anpassen (Verarbeitung | Phasenkorrektur | Manuelle Korrektur). Manuelles Korrigieren der Baseline durch sorgfältiges Festlegen von Nullpunkten (Verarbeitung | Geplante | Mehrpunkt-Baseline-Korrektur). Signalkalibrierung. Setzen Sie das Signal für das phosphitylierte Wasser auf den chemischen Verschiebungswert von 132,2 ppm (Analysis | Referenz | Referenz).HINWEIS: Das Vorhandensein eines scharfen 31P-Signals bei 175 ppm ist auf den Überschuss an TMDP zurückzuführen. Seine Anwesenheit gewährleistet die vollständige Derivatisierung der Probe. Wenn dieser Peak nicht vorhanden ist, muss man das gesamte Verfahren erneut überprüfen, indem man eine gründliche Proben- und Lösungsmitteltrocknung bereitstellt und mehr TMDP hinzufügt. Ist dies gewährleistet, wird das Spektrum im Spektralbereich 132 bis rund 150 ppm gezoomt (Abbildung 7). Abbildung 7: Überprüfen Sie das Vorhandensein eines Überschusses an TMDP: Wenn es zu sehen ist, ist die Derivatisierung der Probe abgeschlossen. Die Spektren können dann analysiert werden. Zoomen Sie dazu im Spektralbereich zwischen 155 und 132 ppm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Integration Normalisieren Sie die Integration, indem Sie den internen Standard auf 1.0 setzen (klicken Sie auf die Peak | Integrale | bearbeiten Normalisiert: 1,00). Führen Sie die Spektrumintegration gemäß den in den folgenden Tabellen angegebenen chemischen Verschiebungen durch. Verwenden Sie Tabelle 2 für Lignine und Tabelle 3 für Tannine. FUNKTIONELLE GRUPPE CHEMISCHE VERSCHIEBUNG (ppm) Aliphatische OH 149.0-146.0 Phenolisches OH 144.0-137.4 C5-substituiertes phenolisches OH 143.0-140.2 5-5′ phenolisches OH 141.7-140.2 Syringyl OH 143.2-142.7 4-O-5′ OH 142.8-141.7 Guaiacyl OH 140.2-138.8 p-Hydroxyphenyl OH 138.8-137.4 COOH 136.0-133.6 Tricin 137.0-136.0 Tabelle 2: 31P NMR-chemische Verschiebungen für Ligninphosphitylierte OH-Gruppen. FUNKTIONELLE GRUPPE CHEMISCHE VERSCHIEBUNG (ppm) Ring A o-unsubstituiertes Phenol 137.9–137.4 o-substituiertes PHENOLIC 138.8–137.9 Ring B Catechol OH 140.2–138.8 Pyrogallol OH 144.0–140.2 Ring C AliphatiC OH 146.0–145.0 Tabelle 3: 31P NMR chemische Verschiebung für Tanninphosphitylierte OH-Gruppen. HINWEIS: Mit einer Standard-Spektralverarbeitungssoftware ist es möglich, vordefinierte Bereiche der zu integrierenden chemischen Verschiebung einzustellen. Diese Möglichkeit ist vorteilhaft, wenn mehrere Spektren verarbeitet werden müssen. 7. Quantifizierung funktionaler Gruppen Berechnen Sie die Konzentration der IS-Lösung. Berechnen Sie die äquivalente Menge des spezifischen Signals:

Representative Results

Das beschriebene Protokoll kann sowohl für die Analyse von Ligninen als auch von Tanninen angewendet werden. In der Ligninchemie ist diese Methode von grundlegender Bedeutung, da sie den Nachweis und die Quantifizierung der verschiedenen Arten von Hydroxygruppen ermöglicht. Abbildung 8A-D zeigt Beispiele für 31P NMR-Spektren von Ligninen und Tanninen, die mit Spektrometern aufgenommen wurden, die mit verschiedenen Frequenzen arbeiten. Das in Abbildung 8A gezeigte Spektrum wurde mit einem 300-MHz-NMR-Spektrometer aufgezeichnet, während Abbildung 8D mit einem 700-MHz-NMR-Instrument aufgezeichnet wurde. Abbildung 8: Quantitatives 31P NMR-Spektrum von (A) Weichholz-Kraft-Lignin (Spektrum aufgezeichnet mit einem 300-MHz-Spektrometer auf 30,8 mg Lignin), (B) Weichholz-Lignosulfonsäure (Spektrum aufgezeichnet mit einem 300-MHz-Spektrometer auf 30,1 mg Lignin nach Konservierung von Lignosulfonat zu Lignosulfonsäure), (C) Akazientannin (Spektrum aufgezeichnet mit einem 300-MHz-Spektrometer auf einer 30,3-mg-Probe) und (D) Nadelholz-Kraftlignin (Spektrum aufgezeichnet mit einem 700-MHz-Spektrometer auf 7,2 mg Lignin). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Diese Spektren wurden sorgfältig aufgezeichnet und manuell verarbeitet. Die typischen Signale für aliphatische (150-145 ppm), aromatische (145-137 ppm) und carbonische (136-134 ppm) Hydroxygruppen sind sehr gut aufgelöst und als solche leicht integriert. Wird das Spektralfenster geöffnet (von 95 bis 190 ppm, Abbildung 8),sind drei scharfe, starke Peaks (175, 144 und 132 ppm) sichtbar. Diese sind auf den Überschuss an TMDP, dem internen Standard (Cholesterin oder NHND) und dem hydroxylierten TMDP (verursacht durch Wasserspuren) zurückzuführen. Im Gegensatz zu Kraft- und Organosolv-Lignin sind Lignosulfonate im Pyridin/Chloroform-Gemisch unlöslich. Um ein zuverlässiges NMR-Spektrum von 31P zu erhalten, ist die Löslichkeit zwingend erforderlich. Um dieses Problem zu lösen, können Lignosulfonate vor der Derivatisierung in die entsprechenden Lignosulfonsäuren umgewandelt werden. Die Behandlung von Lignosulfonatlösungen mit starken Säuren (z. B. Schwefelsäure) oder sauren Austauschharzen (z. B. Dowex 1H, ein starker Säurekationenaustauscher) treibt die Umwandlung aller Sulfonatgruppen in ihre sauren Formen voran. Die resultierenden Produkte können aus der sauren Lösung mit selektiven adsorptiven Harzen (XAD-7, einem polaren Adsorbens zur Isolierung von Verbindungen, die durch Molekulargewichte von bis zu 60.000 u.m.a. gekennzeichnet sind) entfernt werden, die mit diesem Protokoll analysiert werden. Abbildung 8B zeigt das quantitative 31P NMR-Spektrum einer TMDP-derivatisierten Lignosulfonsäure. Auch in diesem Fall sind die unterschiedlichen Signale der Hydroxygruppen offensichtlich. Abbildung 8C zeigt ein typisches quantitatives 31P NMR-Spektrum einer mit TMDP derivatisierten Tanninprobe. Ein charakteristisches Signal der verschiedenen aliphatischen OH (Ring C), Pyrogallol- und Katecholeinheiten in Ring B und Einheiten in Ring A sind gut sichtbar.

Discussion

Die beschriebene Methode stellt die Implementierung und Optimierung des analytischen Protokolls zur qualitativen und quantitativen Charakterisierung von Ligninen^dar,wie es von Argyropoulos³⁷,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²entwickelt wurde. Im Vergleich zu vielen anderen Techniken, die für die Ligninstrukturaufklärung verfügbar sind, wurde die Methode weithin als eine der einfachsten, schnellsten und reproduzierbarsten anerkannt. Die Gültigkeit der nasschemischen Methoden (z. B. Nitrobenzol, Permanganatoxidationen usw.) hängt von den guten experimentellen Fähigkeiten des Bedieners ab, wodurch die Methode effektiv auf begrenzte Bediener beschränkt wird. Darüber hinaus ist es nicht ungewöhnlich, dass in der Literatur Korrekturfaktoren für nasschemische Methoden auftreten, um mehrere Nachteile zu erklären. Das beschriebene ³¹P NMR-Protokoll erfordert keine fortgeschrittenen experimentellen Fähigkeiten, wodurch dies leicht anwendbar, benutzerfreundlich und allgemein verfügbar ist. Im Vergleich zu anderen instrumentellen Analysemethoden ist ^{die 31}P NMR die einzige Technik, die in der Lage ist, die verschiedenen Hydroxygruppen in Ligninen präzise zu detektieren und zu quantifizieren. Zum Beispiel kann FTIR verwendet werden, um verschiedene Hydroxygruppen wie ¹H NMR zu identifizieren. Beide Techniken leiden jedoch, da sie aufgrund umfangreicher Signalüberlappungsprobleme keine zuverlässigen quantitativen Daten bieten können. Eine weitere weit verbreitete Technik ist die UV-Vis-Spektroskopie, über die zuerst Goldschmid berichtete. Der Ansatz beschränkt sich jedoch auf eine allgemeine Gesamtbestimmung von Hydroxygruppen, da er nicht effektiv zwischen aliphatischen, aromatischen und carbonischen OHs⁴⁷unterscheiden kann.

Aus wirtschaftlicher Sicht ist die einzige Einschränkung der ³¹P NMR-Technik der Preis von TMDP, einem relativ teuren Reagenz. Es kostet etwa 190 USD pro Gramm; Würden die Analysekosten also nur auf den TMDP-Preis angenähert, ohne die aus dem Pyridin/Chloroform-Gemisch stammenden Kosten und die kosten der Betreiberzeit, würden sie sich auf etwa 24 USD pro Analyse belaufen. Um dieses Problem zu lösen, greifen viele Labore auf die Synthese von TMDP zurück, wodurch die Reagenzienkosten gesenkt werden. Dazu werden Pinacol und Phosphortrichlorid in Gegenwart von Triethylamin⁴⁴umgesetzt. Technisch ist diese Reaktion relativ einfach; Bei der Verwendung von Phosphortrichlorid und seiner Aufarbeitung, einschließlich einer gut kontrollierten Vakuumdestillation, ist jedoch Vorsicht geboten. Weitere Details zur Synthese des TMDP können auf Anfrage geliefert werden.

Obwohl dieses Protokoll in Bezug auf Leichtigkeit, Reproduzierbarkeit und Präzision zu den besten gehört, müssen einige kritische Punkte hervorgehoben werden. Erstens muss die Probe in dem identifizierten Pyridin/Chloroform-Gemisch vollständig löslich sein. Diese Überlegung ist grundlegend, da die quantitative Phosphylierungsreaktion der Hydroxylgruppen unter völlig homogenen Bedingungen stattfinden muss. Wenn nur ein Teil der Probe solubilisiert wird, wäre die resultierende Analyse ungenau. Zweitens muss die zu untersuchende Probe feuchtigkeits- und lösungsmittelfrei sein, da sich diese Variablen nachteilig auf die Präzision und den Gesamterfolg der Analyse auswirken. Spuren von Feuchtigkeit reagieren mit TMDP und ergeben 2-Hydroxy-4,4′-5,5′-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholan. Diese Verbindung ist ein hellgelbes Flockungssalz, das im Pyridin/Chloroform-Lösungsmittelgemisch unlöslich ist und eine unzureichende NMR-Signalerfassung verursacht. Da nur ein geringes Gewicht (~30 mg) einer Probe erforderlich ist, muss sie frei von flüchtigen Angaben sein, damit ihr genaues Gewicht vor der Analyse genau bekannt ist.

Manchmal können Probensolvierungsprobleme (insbesondere bei stark oxidierten Proben) gefördert werden, indem kleine Mengen eines Co-Lösungsmittels (z. B. Dimethylformamid) hinzugefügt werden, wodurch die Probenauflösung unterstützt wird. Prinzipiell kann jedes Lösungsmittel, das nicht mit TMDP interagiert, zur Probenauflösung verwendet werden. Die Wahl eines Co-Lösungsmittels kann keine Co-Lösungsmittel umfassen, die labile Hydroxy- oder Aminogruppen enthalten, da sie mit dem Reagenz reagieren und irreführende Endspektren verursachen. Insbesondere reagiert Dimethylsulfoxid auch mit TMDP, was seine Verwendung als Co-Lösungsmittel ausschließe. Pyridin-basierte ionische Flüssigkeiten, wie 1-Allyl-3-butylpyridiniumchlorid, können verwendet werden, wenn Löslichkeitsprobleme auftreten; Die ionische Flüssigkeit sollte jedoch noch einmal trocken sein⁴⁸. Zur Auflösung von Lignosulfonaten (ein Lignintyp, der sich durch einen hohen Sulfonierungsgrad auszeichnet) erwies sich eine Vorbehandlung mit der Umwandlung neutralisierter Gruppen in ihre saure Form als hilfreich. Lignosulfonate können mit sauren Austauschharzen in wässrigen Medien bequem in ihre sauren Bedingungen umgewandelt werden. Die resultierenden Lignosulfonsäuren werden durch ihre Adsorption an spezifischen Harzen (z. B. XAD-7) und die Desorption in Ethanol aus der Lösung isoliert. Die Verdampfung der ethanolischen Lösungen bei reduziertem Druck bei 40 °C ermöglicht die Isolierung von Lignosulfonsäuren. Diese Lignine können dann durch ³¹P NMR charakterisiert werden, da sie in dem im Protokoll vorgeschlagenen Pyridin/Chloroform-Gemisch löslich sind.

Eine längere Vakuumtrocknung bei milden Temperaturen reduziert effektiv die Menge an Feuchtigkeit und anderen flüchtigen Bedingungen in jeder Probe. Insbesondere kleine Wassermengen haben keinen Einfluss auf das endgültige Spektrum, da TMDP im Übermaß zugesetzt wird. Darüber hinaus kann in einigen Fällen eine kleine Menge 2-Hydroxy-4,4′-5,5′-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospanon aus der Feuchtigkeit im NMR-Röhrchen oder in der Probendurchstechflasche resultieren. In diesen Fällen reicht das Rühren aus, um die Menge des gebildeten Niederschlags vollständig aufzulösen. Wenn eine hohe Menge an 2-Hydroxy-4,4′-5,5′-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholan gebildet wird, wird empfohlen, die Probenvorbereitung zu wiederholen und die Trocknungsbehandlung zu verbessern. Zum Beispiel können vor dem Gebrauch alle Glaswaren kurz mit einer Heißluftpistole erhitzt werden.

Der Spektralbereich, der zur Aufzeichnung des Spektrums verwendet wird, ist breit im Vergleich zu dem für das Signal interessierende Bereich in Bezug auf die verschiedenen Hydroxylgruppen. Dies ist jedoch zwingend erforderlich, um zu verstehen, ob die Probenderivatisierung erfolgreich durchgeführt wurde. Die Bestätigung der vollständigen Probenderivatisierung wird durch das Vorhandensein eines starken Signals um 174 ppm gegeben. Dieser scharfe Peak ist auf das nicht umgesetzte TMDP zurückzuführen, und seine Existenz stellt sicher, dass das Reagenz im Übermaß vorhanden war und daher alle Hydroxylgruppen derivatisiert wurden. Wenn dieser Peak nicht vorhanden ist, sind die beiden wahrscheinlichsten Ursachen: (1) Die Menge an TMDP reicht nicht aus, um die vollständige Derivatisierung der Probe durchzuführen, oder (2) eine hohe Menge an Wasser ist in der Probe vorhanden. Im ersten Fall würde die Verwendung einer höheren Menge an TMDP wahrscheinlich die vollständige Derivatisierung der Probe sicherstellen, und das Signal bei 174 ppm wird erscheinen. Im zweiten Fall sollte die Probe ausgiebiger getrocknet werden. Sobald ein Überschuss an TMDP sichergestellt ist, kann eine Spitzenintegration durchgeführt werden. Zoomen Sie vor diesem Vorgang auf ein schmaleres Fenster (150 bis 132 ppm), das die interessierenden Signale einschränkt.

Die Menge der zu analysierenden Probe (~ 30 mg), die im obigen experimentellen Protokoll angegeben ist, wurde ausgewählt, um Spektren guter Qualität für ein 300-MHz-NMR-Spektrometer oder mehr zu sammeln. Dennoch haben wir beobachtet, dass es möglich ist, die Probenmenge zu reduzieren, wenn ein 500 MHz oder höherer Feldmagnet verwendet wird. In Abbildung 8Dist beispielsweise das NMR-Spektrum (resultierend aus einem 700-MHz-Instrument) einer mit 7,2 mg Lignin präparierten Probe dargestellt. Die Signalintegration dieses Spektrums bietet die gleichen Ergebnisse wie bei Verwendung höherer Ligninmengen. Diese Tatsache verstärkt die Anwendbarkeit dieses Protokolls für alle Forschungen, in denen kleine Mengen von Produkten verfügbar sind.

Insgesamt kann dieses experimentelle Protokoll auf viele Forschungs- und Entwicklungsanwendungen angewendet werden, wenn das Verständnis der Herkunft und des Verbleibs der verschiedenen Hydroxygruppen in Ligninen und Tanninen erforderlich ist. Insbesondere in Verbindung mit GPC- und HSQC-Daten bieten die resultierenden Daten die Möglichkeit, die Struktur von Lignin oder einem Tannin weiter auszuarbeiten und zu spekulieren. In vielen Fällen, in denen chemische Modifikationen auf die Hydroxygruppen von Lignin oder einem Tannin angewendet werden, können quantitative ³¹P NMR-Analysen äußerst wertvoll sein, um festzustellen, ob und in welchem Ausmaß diese Modifikationen aufgetreten sind. Abbildung 9 zeigt beispielsweise zwei NMR-Spektren desselben Lignins vor und nach seiner Oxidation. Eine einfache qualitative Auswertung zeigt die Reduktion sowohl aliphatischer als auch aromatischer Hydroxygruppen bei oxidation und liefert somit wertvolle Informationen und Orientierungshilfen.

Abbildung 9: Quantitative ³¹P NMR-Spektren desselben Organosolv-Lignins, derivatisiert mit TMDP (A) Vor und (B) nach seiner Oxidation. Die Spektren wurden mit einem 300 NMR-Spektrometer aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Technik alle Attribute aufweist, zu den wichtigsten und leistungsfähigsten Werkzeugen zu gehören, wenn Anfragen, die sich mit polyphenolischen, OH-haltigen Ligninen und Tanninen (und sogar synthetischen Polymeren)^{befassen 49}^,⁵⁰^,⁵¹ in einer Vielzahl von Bereichen durchgeführt werden müssen, von chemie bis ingenieurwesen, von Biologie bis Polymer und pharmazeutischen Anwendungen.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde im Laufe der Jahre durch verschiedene finanzielle Auszeichnungen unterstützt, darunter Organisationen wie das Pulp and Paper Research Institute of Canada, die McGill University Montreal, der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, die National Science Foundation USA, das Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten und das Unternehmen Solvay.

Materials

100 – 1000 µl Eppendorf micropipette	VWR	613-0866
20 – 200 µl Eppendorf micropipette	VWR	613-0865
2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95%	Sigma-Aldrich	447536
Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg)	Precisa	LX220 A
Binder Vacuum Oven	Binder	VD53
Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100	Sigma-Aldrich	29651-U
Chloroform-d	Sigma-Aldrich	151823
Cholesterol, Sigma-grade	Sigma-Aldrich	C8667
Molecular sieves, 4A	Sigma-Aldrich	208604
N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97%	Sigma-Aldrich	226378
NMR spectrometer, 300 MHz	Bruker
Norell natural quartz 3 mm NMR tubes	Sigma-Aldrich	NORS33007
Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue)	VWR	613-0342
Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow)	VWR	613-0239
Pyridine, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich	270970
Stirring bars,micro, 3 mm lenght	VWR	442-0360
Stirring bars,micro, 6 mm lenght	VWR	442-0362
Triphenylphospine oxide, 97%	Sigma-Aldrich	T84603
Vials for environmental analysis, WHEATON, 20.00 mL	DWK Life Sciences	WHEAW224609
Weighing paper, grade 531	VWR	516-0318P

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Citar este artigo

Argyropoulos, D. S., Pajer, N., Crestini, C. Quantitative ³¹P NMR Analysis of Lignins and Tannins. J. Vis. Exp. (174), e62696, doi:10.3791/62696 (2021).