Uso de ultrassom robótico 3D para análise in vivo de rins de rato
Summary
Este protocolo demonstra o ultrassom robótico (EUA) como uma alternativa prática, econômica e rápida às modalidades tradicionais de imagem não invasiva.
Abstract
As modalidades comuns para imagem in vivo de roedores incluem tomografia de emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada (TC), ressonância magnética (RM) e ultrassom (EUA). Cada método tem limitações e vantagens, incluindo disponibilidade, facilidade de uso, custo, tamanho e uso de radiação ionizante ou campos magnéticos. Este protocolo descreve o uso de US robótico 3D para imagens in vivo de rins e coração de roedores, análise de dados subsequentes e possíveis aplicações de pesquisa. Aplicações práticas de US robótica são a quantificação do volume renal total (TKV), bem como a medição de cistos, tumores e vasculatura. Embora a resolução não seja tão alta quanto outras modalidades, os EUA robóticos permitem uma coleta de dados de alto rendimento mais prática. Além disso, usando imagens do modo M dos EUA, a função cardíaca pode ser quantificada. Como os rins recebem de 20%-25% da produção cardíaca, avaliar a função cardíaca é fundamental para a compreensão da fisiologia renal e da fisiopatologia.
Introduction
As modalidades mais comuns para imagem de roedores in vivo incluem tomografia de emissão de pósitrons (PET), imagem óptica (OI), tomografia computadorizada (TC), ressonância magnética (RM) e ultrassom (EUA). Essas técnicas fornecem imagens in vivo de alta resolução, permitindo que os pesquisadores avaliem quantitativamente e sigam longitudinalmente modelos de doenças não invasivamente1. Embora cada modalidade de imagem tenha limitações, elas também fornecem ferramentas inestimáveis para pesquisas pré-clínicas.
Aqui, o estudo detalha um sistema dos EUA e apresenta o protocolo para imagens robóticas e roedores 3D. As ondas americanas são produzidas por uma sonda chamada transdutor, que é tipicamente portátil. As ondas sonoras são refletidas de volta à medida que interagem com tecidos, e os ecos são reconstruídos em imagens2. O protocolo descrito aqui se concentrará em imagens renais e cardíacas usando um transdutor roboticamente controlado e usando um software que permite reconstrução 3D rápida para avaliação quantitativa.
Robotic US é uma modalidade de imagem rápida, confiável e não invasiva que permite aos investigadores realizar estudos longitudinais e de alta produtividade. Comparado aos métodos manuais dos EUA, o método robótico dos EUA é eficiente no tempo, já que até três animais podem ser escaneados em questão de minutos. O alto rendimento das medidas renais sugere que até 20 ratos por hora podem ser imagens. Os transdutores robóticos estão localizados sob as membranas acústicas e se movem independentemente do animal com dois graus de liberdade (Figura 1A). Isso permite que os usuários iniciantes obtenham imagens de alta qualidade, enquanto os métodos dos EUA portáteis são mais suscetíveis ao erro do usuário. O software acoplado permite uma reconstrução renal 3D eficiente e em tempo real. Anteriormente, a ressonância magnética (RM) tem sido um método prevalente para imagens não invasivas devido ao excelente contraste de tecido mole, falta de radioatividade e profundidade de penetração. No entanto, a ressonância magnética muitas vezes requer longos tempos de aquisição e é cara para realizar. Os EUA têm sido avaliados como uma alternativa confiável e mais rápida à ressonância magnética na avaliação do volume total dos rins (TKV)3.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ultrassom utiliza ondas sonoras, e quaisquer barreiras à propagação de ondas sonoras interferirão na qualidade da imagem. Assim, a depilação completa da área a ser imagem é fundamental. Também é importante garantir a remoção completa do creme depilatório, pois pode causar queimaduras/irritação da pele do animal e descolorir a membrana transparente do scanner. Níveis de água adequados nas baias são necessários para a propagação ideal de ondas sonoras, necessária para a obtenção da maior resolução de imagem. No entanto, quando o animal estiver em uma posição propensa, certifique-se de que o focinho do animal esteja acima do nível da água ou o animal esteja em risco de inalação de água. A otimização dos parâmetros de imagem, especialmente a profundidade focal, é fundamental para a obtenção de imagens de alta qualidade. Modificações nos parâmetros podem ser necessárias para animais individuais.
A robótica dos EUA oferece muitas vantagens sobre as modalidades tradicionais dos EUA. Primeiro, o sistema usa uma interface simples baseada em câmera de ponto e clique. Esse recurso aborda a complexidade dos EUA convencionais e produz dados consistentes mesmo quando operado por um usuário iniciante6. Em segundo lugar, o sistema permite o uso de água em vez de gel tradicional dos EUA como um meio acústico. Anteriormente, o uso de gel americano permitia a formação de bolhas que interferissem na aquisição de imagem de qualidade. Além disso, o gel dos EUA é bagunçado e oferece desafios para a limpeza. Além disso, a água é aquecida pela lâmpada de calor e ajuda a manter a temperatura corporal do animal. Terceiro, o US robótico é mais rápido, então artefatos do movimento respiratório não são problemáticos. O aumento da velocidade de imagem permite a conclusão prática da coleta de dados de alto rendimento. Em quarto lugar, o US robótico obtém imagens 3D e, portanto, torna a reconstrução 3D de objetos simples (Figura 4). A ressonância magnética e outras modalidades são caras, demoradas e nem sempre estão disponíveis. É importante ressaltar que o sistema robótico dos EUA se encaixa em uma mesa ou banco e é mais econômico. Finalmente, trabalhos anteriores demonstraram que os EUA robóticos poderiam fornecer dados de medição comparáveis a modalidades mais caras, como a MRI3.
Embora a qualidade da imagem e a resolução do sistema robótico dos EUA descritos neste trabalho tenham sido adequadas para a aplicação proposta (Figura 7), existem várias maneiras de que a qualidade da imagem possa ser melhorada no futuro. Por exemplo, utilizar transdutores de maior frequência (por exemplo, 50-70 MHz) resultaria em imagens de maior resolução com melhor definição de recursos. Embora utilizar frequências mais altas resultaria em uma menor profundidade de penetração, as imagens devem ser suficientes para imagens in vivo de órgãos superficiais, como o rim do rato. Assim como outras modalidades de imagem, os agentes de contraste podem ser usados para aprimorar características específicas. Para os EUA, isso normalmente significa usar algo altamente reflexivo de ondas sonoras. Microbolhas intravasculares em que lipídios cercam bolhas de gás muito pequenas são um desses agentes. As bolhas de gás do tamanho de micron são altamente reflexivas e, portanto, fornecem um segundo sinal distinto que se traduz em uma alta resolução de vasculatura7. Embora esta técnica de contraste acústico possa ser bastante útil, pode ter várias desvantagens. Primeiro, os microbolhas devem ser frescos e só persistem in vivo por 5-10 min. Em segundo lugar, a injeção intravascular in vivo normalmente requer cateterismo do véu de cauda para injeção, e isso pode ser tecnicamente desafiador. Sob certas circunstâncias e regimes pulsantes, a imagem de microbolhas pode levar a danos à vasculatura renal8.
Há também algumas limitações mais gerais do sistema dos EUA em particular utilizado. Primeiro, apenas uma matriz linear (centrada em 18 MHz) está incluída no chassi robótico, portanto, mudar para sondas de maior ou menor frequência não é atualmente possível. Isso pode impactar a amplitude de modelos (maiores ou menores) que podem ser avaliados com o sistema. As futuras iterações do instrumento devem incluir múltiplas matrizes lineares para cobrir toda a gama de modelos animais pré-clínicos. Em segundo lugar, o ângulo do transdutor em relação ao objeto animal não pode ser controlado. Portanto, a realização de técnicas de imagem dependentes de ângulos, como Doppler, ou alcançar visões alternativas in-plane de determinados órgãos (por exemplo, visão de eixo longo do rim) requer reposicionamento do animal e pode ser difícil de alcançar. Graus adicionais de liberdade poderiam ser adicionados ao movimento robótico para amenizar esse desafio. Em terceiro lugar, na ocasião, observamos artefatos de reverberação decorrentes da membrana acústica que separa o animal do transdutor que pode obscurecer a visualização de características e limites superficiais. Nesses casos, o uso de um impasse em gel para elevar o animal para longe da membrana pode remediar a situação. Finalmente, o controle de temperatura via lâmpada de calor é impreciso e, portanto, deve-se prestar muita atenção à temperatura corporal do núcleo do animal durante a imagem. Mecanismos de aquecimento mais controlados, como uma almofada de aquecimento integrada, provavelmente melhorarão o gerenciamento de homeostase e o throughput de imagem.
O uso de US robótica pode ser aplicável a vários campos de pesquisa. Essa tecnologia permite a visualização de estruturas de tecidos brutos, podendo, assim, ser utilizada para acompanhar a progressão do tumor e terapias potenciais6,9, bem como a morfologia renal apresentada aqui. A capacidade de segmentar as características específicas das imagens torna-a uma ferramenta atraente para estudar modelos de doença renal policística (PKD)3. As imagens do modo M permitem uma quantificação simples de muitos parâmetros cardíacos importantes que permitem a avaliação in vivo da fisiologia cardíaca. Como os rins recebem 20%-25% da saída cardíaca10, a compreensão da função cardíaca durante a avaliação longitudinal da patologia renal é importante. Através desses protocolos norte-americanos, tentamos ilustrar que a imagem dos EUA não é apenas prática para estudos renais in vivo e longitudinal, mas também que ferramentas cada vez mais americanas permitem tanto a morfológica quanto a avaliação fisiológica de camundongos em estudos pré-clínicos.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NIH (R43-DK126607, TJC, TLK, MFR) e pela Fundação Mayo.
Materials
| Electric Razor | Braintree Scientific, Inc | CLP-9868 14 | |
| C57bk6j | The Jackson laboratory | https://www.jax.org/ | |
| Cotton gauze pads | Fisher Scientific | ||
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | ||
| Depilatory cream | N/a | N/a | This study used Nair |
| Heat lamp | Included with SonoVol Vega system | ||
| Robotic Ultrasound System | SonoVol Inc | SonoVol Vega system includes anesthesia system | |
| SonoEQ Software | SonoVol | Included with SonoVol Vega system | |
| TERRELL Isoflurane | Piramal Critical Care, Inc | NDC 66794-019-10 |
Referências
- Cunha, L., et al. Preclinical imaging: an essential ally in modern biosciences. Molecular Diagnostics & Therapy. 18 (2), 153-173 (2014).
- Ultrasound. NIBIB Available from: https://www.nibib.nih.gov/science-education/science-topics/ultrasound#pid-936 (2016)
- Beaumont, N. J., et al. Assessing polycystic kidney disease in rodents: Comparison of robotic 3d ultrasound and magnetic resonance imaging. Kidney360. 1 (10), 1128-1136 (2020).
- Hopp, K., et al. Functional polycystin-1 dosage governs autosomal dominant polycystic kidney disease severity. The Journal of Clinical Investigation. 122 (11), 4257-4273 (2012).
- Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).
- Czernuszewicz, T. J., et al. A new preclinical ultrasound platform for widefield 3D imaging of rodents. Review of Scientific Instruments. 89 (7), 075107 (2018).
- Chong, W. K., Papadopoulou, V., Dayton, P. A. Imaging with ultrasound contrast agents: current status and future. Abdominal Radiology (NY). 43 (4), 762-772 (2018).
- Nyankima, A. G., Kasoji, S., Cianciolo, R., Dayton, P. A., Chang, E. H. Histological and blood chemistry examination of the rodent kidney after exposure to flash-replenishment ultrasound contrast imaging. Ultrasonics. 98, 1-6 (2019).
- Rojas, J. D., et al. Ultrasound measurement of vascular density to evaluate response to anti-angiogenic therapy in renal cell carcinoma. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 66 (3), 873-880 (2019).
- Boron, W. F., Boulpaep, E. L. . Medical Physiology. 3rd edn. , (2017).
