使用患者源性肿瘤类器官的高通量 体外 检测

所有涉及人源材料的实验均根据《赫尔辛基宣言》进行，并事先获得福岛医科大学伦理委员会的批准（批准号分别为1953年和2192年;批准日期分别为2020年3月18日和2016年5月26日）。从提供本研究中使用的临床标本的所有患者那里获得了书面知情同意。 1. PDO的培养 注意：F-PDO形成细胞簇，表现出各种异质形态并在悬浮培养物中生长（图1）。此外，F-PDO可以培养超过6个月，并且可以冷冻保存以备将来使用。 储存的 PDO 解冻（第 0 天） 在第0天解冻和种子PDO（例如，RLUN007，肺腺癌）（图1）。首先，将15mL含有1%B-27补充剂和30ng / mL表皮生长因子的PDO培养基（见 材料表）加入无菌的50mL离心管中。 从液氮储存中取出冷冻小瓶后，在37°C水浴中轻轻搅拌PDO2分钟。接下来，从水浴中取出小瓶，用70%乙醇擦拭小瓶，然后将小瓶移入生物安全柜中。 将小瓶的内容物转移到含有15mL用于PDO的培养基的管中。用3 mL移液器轻轻上下移液五次，混合PDO和培养基。在〜25°C下以200×g离心管3分钟，并弃去上清液。 将PDO沉淀重悬于5mL新鲜培养基中，并转移到25 cm2烧瓶中，轻轻移液。 最后，在37°C的培养箱中培养PDO，浓度为5%CO2。 每周更换两次培养基（第3-7天）。离心PDO悬浮液以沉淀细胞簇，并更换4mL培养基（80%体积）。将细胞重悬于新鲜培养基中。注意：大多数RLUN007显示为直径为100-500μm的细胞簇。当介质中酚红的颜色变为黄色时， 如图1A所示，更频繁地更换介质。如果培养基在置换后的第二天变黄，并且每个细胞簇合并形成直径>500μm的较大簇，则以1：2的分裂比通过。 PDO的传代培养（第8-28天）注意：鉴于实际测量单个细胞数量的困难，传代时间是根据适当的细胞簇密度和离心后PDO沉淀的大小确定的（图1B）。在RLUN007的情况下，PDO沉淀的体积在解冻后约2周达到30μL（25 cm2 烧瓶中的饱和密度）。 为了从一个25 cm2烧瓶转移到两个25 cm2烧瓶（P1），将PDO悬浮液转移到离心管中，并在约25°C下以200×g离心2分钟。 估计PDO沉淀的体积，并丢弃上清液。使用5 mL移液器将PDO沉淀重悬于5mL新鲜培养基中。用移液器在低速下轻轻地上下移液五次。然后，将PDO悬浮液（2.5 mL）的一半体积转移到两个烧瓶中，并向每个烧瓶中加入2.5mL新鲜培养基。将细胞在37°C下培养在5%CO2中。 对于从两个25 cm2烧瓶转移到一个75 cm2烧瓶（P2），将PDO悬浮液从两个烧瓶转移到两个离心管中，并在约25°C下以200×g离心PDO2分钟。 接下来，估计PDO沉淀的体积，并将沉淀重悬于2.5mL新鲜培养基（每管）中。此后，将一个管中的PDO悬浮液与另一个管中的PDO悬浮液混合，并将其转移到含有10mL新鲜培养基的75 cm2烧瓶中。将细胞在37°C下培养在5%CO2中。在第一次传代后约1周将亚培养的PDO从两个25 cm 2烧瓶转移到一个75 cm2烧瓶中（图1C）。 2. 生长抑制HTS 注意：通过测量细胞内ATP含量来评估抗癌剂对PDO的生长抑制活性，如图 2所示。该步骤使用市售的细胞活力测定试剂盒（见 材料表）进行。 在第0天，在烧瓶中培养PDO（例如RLUN007），直到有足够数量的细胞簇可用于测定。在播种前一天，将PDO悬浮液从75 cm2烧瓶转移到15 mL管中，并以200×g离心2分钟以测量PDO沉淀体积。然后，将PDO沉淀重悬于15mL新鲜培养基中，并将其转移回75cm2烧瓶中。将细胞在37°C下培养在5%CO2中。注意：所需的PDO沉淀体积取决于每个PDO的稀释速率和用于测定的384孔板的数量。对于RLUN007，需要200μL细胞沉淀体积才能接种到10个384孔板中。 在第1天（更换培养基后24小时），使用含有70μm目过滤器的过滤器支架使用细胞碎裂和分散设备（见材料表）切碎PDO。然后，将15mL的PDO悬浮液稀释10倍。使用细胞悬浮液分配器将40μLPDO悬浮液接种到384孔超低连接球体（圆底）微孔板（见材料表）中。注意：对于切碎细胞簇，建议使用市售的细胞片段化和分散设备（见 材料表）。 在接种后24小时（第2天），使用液体处理器用0.04μL测试剂溶液处理PDO，最终浓度范围为20μM至1.0nM（10个连续稀释液）（见 材料表）。 在第8天（测试物质处理后144小时），将细胞内ATP测量试剂加入测试孔中。使用混合器混合板并在25°C下孵育10分钟。 使用读板器测量作为发光的细胞内ATP含量（见 材料表）。 为了计算细胞活力，将测试孔中的ATP量除以包含载体的对照孔中的ATP量，并减去背景。为了计算6天内的生长速率，将车辆控制井中的ATP数量除以播种后24小时车辆控制井中的ATP量。 使用生物数据分析软件从剂量 – 反应曲线中计算50%的抑制浓度（IC50）和曲线下面积（AUC）值（见 材料表）。Z 因子是一个无量纲参数，范围从 1（无限分离）到 <0，定义为 Z = 1 – （3σc+ + 3σc-） / |μc+ – μc-|，其中 σc+、σc-、μc+ 和 μc- 分别是高 （c+） 和低 （c−） 控制14的标准差 （σ） 和平均值 （μ）。 3. HTS具有细胞拾取和成像系统，用于抑制生长 注意：如果使用方案2的数据中存在较大的偏差（当测定时的变异系数[CV]大于20%），则可以使用细胞拾取和成像系统将选定大小的PDO接种到96孔或384孔板中（图2）。该协议与上一节中的步骤 2.1 和 2.2 中描述的协议相同。该步骤是使用市售的细胞拾取和成像系统执行的（请参见 材料表）。 在第1天，在细胞拾取和成像系统上设置一个384孔超低附着球体微孔板，其中40μL培养基/孔作为目标板。 用6 mL培养基填充拣选室（见材料表），并以1，500×g离心2分钟以除去气泡。将悬浮在培养基中的PDO（PDO沉淀体积，4μL）加入拣选室并设置在系统上。 将腔室静置至少1分钟，然后分散，使细胞簇沉降在腔室底部;然后，对腔室进行扫描。 在系统上将拾取尺寸设置为140-160μm（面积15，386-20，000μm2），以自动选择细胞簇。接下来，检查扫描图像上所选细胞簇的质量，并使用拾取技巧（参见材料表）将每个孔中的十个细胞簇转移到目标板中。 从步骤 2.3 开始执行协议步骤。 4. HTS治疗抗体依赖性细胞毒性 注：此步骤是使用市售系统（见 材料表）执行的，该系统是一种电阻抗测量仪器。它用于通过单克隆抗体和自然杀伤（NK）细胞的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）评估PDO的细胞溶解（图3）。NK细胞是按照制造商的说明，使用NK细胞生产试剂盒（见 材料表）从外周血单核细胞中生产的。 ADCC活性的测量 在第0天，在4°C下用50μL10μg/ mL纤连蛋白溶液（0.5μg/孔）涂覆96孔板（ 见材料表）过夜。 在第1天，在除去纤连蛋白溶液后，向每个孔中加入50μL培养基以测量背景阻抗。 在接种之前，将5mL细胞培养解离试剂（见 材料表）加入PDO（RLUN007：100μLPDO沉淀在75cm2 烧瓶中），并在37°C的CO2 培养箱中孵育20分钟以分散PDO。要停止胰蛋白酶消化，加入5mL培养基，离心并除去解离试剂。用新鲜培养基冲洗PDO，并通过40μm细胞过滤器过滤（见 材料表）。 使用细胞活力分析仪计算细胞数量（见 材料表）。 将PDO悬浮液转移到储液槽并使用多通道移液器混合。将PDO悬浮液加入96孔板中以5×104 个细胞/孔的孔中。每个孔包含100μL的最终体积。然后，将板置于约25°C的生物安全柜中30分钟。 将板转移到37°C的CO2 培养箱中的仪器中。 每15分钟记录阻抗信号的变化作为细胞指数。 在PDO接种的同一天在37°C水浴中解冻NK细胞。将细胞从小瓶转移到含有10 mL培养基的15 mL管中（见材料表），并在约25°C下以300×g离心5分钟。 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于10mL新鲜培养基中。细胞计数后，将细胞密度调节至1×106个细胞/ mL并转移到75cm2烧瓶中。在37°C的5%CO2培养箱中培养NK细胞。 第2天，在无菌V-bottom 96孔板中以终浓度的10倍制备抗体溶液（磷酸盐缓冲盐水）。 从每个孔中取出60μL培养基，并向PDO中加入10μL曲妥珠单抗或西妥昔单抗溶液（10μg/ mL，1μg/ mL和0.1μg/ mL）。将板移回培养箱中的仪器并记录细胞指数1小时。 将NK细胞悬浮液转移到50mL管中并计数细胞数。将细胞以300×g离心5分钟，并将NK细胞密度调节为1×106个细胞/ mL和2 x 106个细胞/ mL，用于PDO的培养基。 以1：1或2：1的目标（RLUN007）细胞比例向效应子（NK）细胞中加入50μLNK细胞悬浮液。抗体的最终浓度为1 μg/mL、0.1 μg/mL和0.01 μg/mL。将板保持在约25°C下15分钟，然后将板返回仪器。 数据收集和分析 使用分析软件将细胞指数转换为细胞溶解百分比值（见 材料表）。 细胞溶解百分比是指NK细胞与单独作为对照的靶细胞（PDO）杀死的靶细胞的百分比。在每个时间点从样品孔的索引中减去仅包含NK细胞的孔的细胞指数。在添加抗体之前，立即将每个值归一化为细胞指数。使用以下等式将归一化细胞指数转换为细胞溶解百分比：细胞溶解百分比=（1 – 归一化细胞指数[样品孔]）/归一化细胞指数（仅靶孔）x 100。