عالية الإنتاجية في المختبر المقايسة باستخدام الجهازيات الورم المستمدة من المريض
Summary
تم تطوير نظام فحص عالي الإنتاجية في المختبر لتقييم الأدوية المضادة للسرطان باستخدام الأجهزة العضوية السرطانية المشتقة من المريض (PDOs) ، على غرار أنسجة السرطان ولكنها غير مناسبة لأنظمة المقايسة عالية الإنتاجية في المختبر مع لوحات 96-well و 384-well.
Abstract
من المتوقع أن تكون الأجهزة السرطانية المشتقة من المريض (PDOs) نموذجا للسرطان قبل السريري مع إمكانية إعادة إنتاج المرض بشكل أفضل من نماذج زراعة الخلايا التقليدية. وقد تم إنشاء PDOs بنجاح من مجموعة متنوعة من الأورام البشرية لتلخيص الهندسة المعمارية ووظيفة أنسجة الورم بدقة وكفاءة. ومع ذلك ، فإن PDOs غير مناسبة لنظام الفحص عالي الإنتاجية في المختبر (HTS) أو تحليل الخلايا باستخدام لوحات 96 جيدا أو 384 بئرا عند تقييم الأدوية المضادة للانسان لأنها غير متجانسة في الحجم وتشكل مجموعات كبيرة في الثقافة. تستخدم هذه الثقافات والمقايسات المصفوفات خارج الخلية، مثل ماتريغل، لإنشاء سقالات أنسجة الورم. لذلك ، فإن PDOs لديها إنتاجية منخفضة وتكلفة عالية ، وكان من الصعب تطوير نظام فحص مناسب. لمعالجة هذه المسألة، تم إنشاء HTS أبسط وأكثر دقة باستخدام PDOs لتقييم فعالية الأدوية المضادة للانسان والعلاج المناعي. تم إنشاء HTS في المختبر الذي يستخدم PDOs المنشأة من الأورام الصلبة المستزرعة في لوحات 384 بئرا. كما تم تطوير HTS لتقييم نشاط السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة لتمثيل الاستجابة المناعية باستخدام PDOs المستزرعة في لوحات 96 بئرا.
Introduction
خطوط الخلايا السرطانية البشرية مقبولة على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا السرطان وتقييم عوامل مضادة للسرطان. ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا هذه لا تحافظ بالضرورة على الخصائص الأصلية للأنسجة المصدر لأن مورفولوجياها ، والطفرة الجينية ، وملف التعبير الجيني يمكن أن تتغير أثناء الثقافة على فترات طويلة. وعلاوة على ذلك، يتم استزراع معظم هذه الخطوط الخلية في طبقة واحدة أو تستخدم ك بوين xenografts، لا يمثل أي منها جسديا أنسجة الورم1،2. وبالتالي، فإن الفعالية السريرية لعوامل مضادة للسرطان قد لا تكون هي نفسها التي لوحظت في خطوط الخلايا السرطانية. لذلك ، تم تطوير أنظمة في المختبر ، مثل المقايسات الجسمية السابقة باستخدام مناظير الورم المشتقة من المريض أو الأجهزة السرطانية المشتقة من المريض (PDOs) ونماذج كروية الورم التي تستنسخ بدقة بنية ووظيفة أنسجة الورم. وتشير الأدلة المتزايدة إلى أن هذه النماذج تتنبأ باستجابة المرضى لعوامل مضادة للسرطان من خلال مقارنتها مباشرة بأنسجة السرطان المقابلة. وقد أنشئت هذه النظم في المختبر لأنواع مختلفة من أنسجة الورم، وما يرتبط بها من نظم المقايسة عالية الإنتاجية (HTS) لفحص المخدرات كما تم تطوير3،4،5،6،7. اكتسبت الثقافات العضوية غير المتجانسة ex vivo من الأورام الأولية التي تم الحصول عليها من المرضى أو xenografts الورم المشتقة من المريض الجر كبيرة في السنوات الأخيرة بسبب سهولة الثقافة والقدرة على الحفاظ على تعقيد الخلايا في الأنسجة السترومية8،9،10. ومن المتوقع أن تعزز هذه النماذج فهم بيولوجيا السرطان وتسهيل تقييم فعالية الدواء في المختبر.
تم إنشاء سلسلة من PDOs رواية مؤخرا من أنواع مختلفة من أنسجة الورم، المعينة باسم F-PDO، في إطار مشروع البحوث الترجمية فوكوشيما. وPDOs تشكل مجموعات خلايا كبيرة مع مورفولوجيا مماثلة لتلك التي من الورم المصدر ويمكن استزراعها لأكثر من ستة أشهر11. أظهرت التحليلات المقارنة للأنسجة والتعبير الجيني الشامل أن ملامح PDOs قريبة من ميزات أنسجة الورم المصدر ، حتى بعد النمو المطول في ظل ظروف الثقافة. وعلاوة على ذلك، تم إنشاء HTS مناسبة لكل نوع من PDO في 96-جيدا و 384-لوحات الآبار. وقد استخدمت هذه المقايسات لتقييم العديد من العوامل المستهدفة الجزيئية والأجسام المضادة. هنا، تم تقييم العلاج الكيميائي القياسي (باكليتاكسيل وكاربوبلاتين) المستخدم لسرطان بطانة الرحم باستخدام F-PDOs المستمدة من مريض لم يستجب للباكليتاكسيل وكاربوبلاتين. وبناء على ذلك، كان النشاط المثبط لنمو الخلية من باكليتاكسيل وكاربوبلاتين ضد هذا PDO ضعيفة (IC50: >10 ميكرومتر). بالإضافة إلى ذلك، ذكرت الأبحاث السابقة أن حساسية بعض F-PDOs للعوامل الكيميائية والعوامل الجزيئية المستهدفة تتفق مع الفعالية السريرية11و12و13. وأخيرا، تم تحليل التغيرات في بنية أعلى ترتيبا من PDOs الناجمة عن عوامل مضادة للانسان باستخدام نظام تحليل الخلايا ثلاثي الأبعاد12،13. نتائج تقييم عوامل مضادة للانسان باستخدام HTS المستندة إلى PDO قابلة للمقارنة مع النتائج السريرية التي تم الحصول عليها لهذه العوامل. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لHTS أبسط وأكثر دقة التي يمكن استخدامها لتقييم فعالية عوامل مضادة للانسان والعلاج المناعي باستخدام نماذج PDO.
Protocol
Representative Results
Discussion
والسمة الفريدة ل PDOs هي أنها لا تنفصل بشكل أنزيمي إلى خلايا واحدة أثناء الثقافة أو الفحص وتحافظ على مجموعات الخلايا في الثقافة. لذلك، لا يمكن حساب عدد الخلايا بدقة تحت المجهر. لحل هذه المشكلة، يتم تحديد عدد الخلايا بصريا عن طريق بطانة أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على الخلايا مع أنابيب ملحوظ مع مستويات ل50-200 ميكرولتر (الشكل 1B). وعلاوة على ذلك، لأنه من الصعب قياس حجم بيليه من مجموعات الخلية المستزرعة في قارورة 2 سم2 بصريا، تم تحديد وقت المرور باستخدام تغيير اللون المتوسط من الأحمر إلى الأصفر والزيادة الملحوظة في خلايا واحدة أو debriscompared مع وقت التمرير كمؤشرات(الشكل 1A،C). هذا هو الهدف من passaging لPDOs. يتم قياس كمية الكريات PDO بصريا بعد الطرد المركزي في كل تغيير متوسط. عندما يتوقف حجم بيليه زيادة، والمتوسط يتحول الأصفر في اليوم التالي لاستبدال المتوسطة، ويعتبر المتوسطة لتكون مشبعة مع الكثافة، ويتم تنفيذ passaging. يتم تعريف حجم بيليه لكل PDO. إذا لم تتكاثر PDOs ، يتم تغيير كمية الوسيطة من 80٪ إلى 50٪ في وقت التبادل المتوسط ، ويتم زيادة كثافة PDOs في الثقافة.
تم تطوير HTS مناسبة لPDOs. الإنتاجية لها ما لا يقل عن عشرة إلى عشرين لوحات 384 جيدا تنفيذها باستخدام قارورة واحدة 75 سم2 من PDO، وعدد لوحات معالجتها يوميا هو ما لا يقل عن 50. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ بالفعل عن نتائج تقييم مختلف الأدوية المضادة للانسان من قبل HTS باستخدام PDOs.
عند تنفيذ HTS ، يتم تناول انسداد مرشح الشبكة الناجم عن زراعة الألغام من F-PDOs باستخدام معدات تفتيت الخلايا وتشتتها في البداية عن طريق تغيير حجم الشبكة للمرشح إلى 100 ميكرومتر. الخطوة التالية هي تقليل حجم تعليق PDO المطبق على السفينة الزجاجية. عند إعداد حلول المواد الاختبارية لHTS ، عادة ما يتم إذابة المركبات منخفضة الوزن الجزيئي في كبريت أكسيد ثنائي ميثيل ، ويتم إذابة الأجسام المضادة في المالحة العازلة بالفوسفات. يستخدم المذيب المناسب كمادة اختبار، ويتم الحصول على بيانات التحكم من المذيب المستخدم.
فيما يلي وصف كيفية التعامل مع التباين في بيانات المقايسة. إذا كان هناك تباين كبير في البيانات في الاختبار باستخدام لوحات 384 بئرا ، فيجب تغيير لوحة الفحص إلى تنسيق لوحة 96 جيدا. عامل تخفيف PDO (عدد مجموعات الخلايا المصنفة) يتم فحصه أيضا بعد بذر اللوحة. وأخيرا، يمكن استخدام نظام التقاط الخلايا والتصوير لتحديد حجم وحدات حفظ البيانات الرقمية للمقايرة. قبل إضافة PDOs إلى الغرفة ، يجب إزالة الخلايا المفردة ومجموعات الخلايا الصغيرة عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة لتكون قادرة على التعرف بشكل صحيح على PDOs. إذا كانت الخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا الصغيرة مرئية بعد إضافة PDOs إلى الغرفة ، يمكن إجراء عمليات تفريق متعددة لإزالة الخلايا المفردة. بعد ذلك ، على الرغم من أن نظام التقاط الخلايا والتصوير له وظيفة تسمح بإبقاء اللوحة دافئة ، إلا أن هذه الوظيفة لا تستخدم بسبب تبخر وسيط الثقافة عندما يعمل النظام لفترة طويلة من الزمن. وأخيرا، حجم مجموعات الخلايا غير معروف لأنه يتم التعرف عليه بواسطة صورة مخطط. علاوة على ذلك، إذا تداخل PDOs اثنين أو أكثر لا يمكن التعرف على PDO واحد بشكل صحيح. ومع ذلك، فمن الممكن لإزالة PDOs غير المرغوب فيها باستخدام وظيفة إزالة عن طريق التحقق منها على الصورة الممسوحة ضوئيا بعد هذه الخطوة.
تستخدم أداة قياس المعاوقة الكهربائية بشكل عام للخلايا السرطانية المستهدفة الملتزمة لرصد التغيرات في المقاومة أثناء انتشار الخلايا. لذلك، لا يتم الكشف عن تغيير في فهرس الخلية من PDOs غير المنضمة. في محاولة لحل هذه المشكلة، فمن الضروري التحقيق في ظروف البذر مثل كثافة PDO والعلاج الأنزيمي (إنزيم تفكك الخلايا ووقت العلاج) اعتمادا على نوع PDO. يجب أيضا أن تكون مغلفة الآبار في لوحة مع مصفوفة خارج الخلية المناسبة للبذر PDOs. يتم بذر PDOs دون علاج أنزيمي ، اعتمادا على نوع PDO. تم استخدام RLUN007 لقياس المعاوقة عن طريق بذر PDOs على لوحة من 96 بئرا بعد تفريقها عن طريق العلاج الأنزيمي. تم علاج RLUN007 مع كاشف تفكك زراعة الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتفريق الخلايا وإرفاقها بالآبار من لوحة 96 بئرا. وبالنظر إلى أن الخلايا RLUN007 فصل تشكل على الفور المجاميع، فمن المستحسن أن البذور على لوحات فقط بعد الترشيح باستخدام مصفاة. بعد نقل تعليق الخلية من الأنبوب إلى الخزان ، تم نقل الخزان بلطف من اليمين إلى اليسار مرتين إلى ثلاث مرات وتم غليه صعودا وهبوطا خمس مرات قبل البذر على اللوحة. كما اختلط التعليق مع كل إضافة إلى البئر. ثم وضعت لوحة في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة (لPDOs) أو 15 دقيقة (لخلايا NK) للسماح للخلايا لتوزيع بالتساوي في البئر. النقطة الثانية الهامة هي أن العلاج بالأجسام المضادة وخلايا NK يجب أن يكون في الوقت المناسب لتحدث قبل أن يصل مؤشر الخلية إلى هضبة والقيمة لا تقل عن 0.5. في حالة RLUN007 ، فإن الوقت الأمثل لبدء الفحص هو 20-22 ساعة بعد الطلاء ، ورقم الخلية للبذر هو 5 × 104 خلايا / جيدا.
بشكل عام، والثقافة والمقايسات لالأورام organoids استخدام المصفوفات خارج الخلية مثل Matrigel لإنشاء سقالات الأنسجة السرطانية أو الإنزيمات مثل التريبسين والكولاجيناز لتعطيل organoids3،4،5،6،7. ميزة هذه الطريقة هي أنه لا يلزم أي مصفوفة خارج الخلية أو علاج أنزيمي أثناء الثقافة والتقييس (باستثناء المقايسات باستخدام أداة قياس المعاوقة الكهربائية) ، مما يقلل بشكل كبير من متطلبات العمالة والتكاليف. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة سهلة نسبيا للتكيف مع أنظمة فحص HTS وأنظمة القياس المختلفة. ومع ذلك ، فإن استخدام مصفوفة خارج الخلية أمر مرغوب فيه لبعض الأغراض البحثية لأنه يمكن أن يكون بمثابة سقالة للخلايا ويؤثر على مورفوجينيسيس ، والتمايز ، و التوازن في الأنسجة.
في هذه الدراسة، تم استخدام PDOs (RLUN007) مع طفرة EGFR (L858R) التي هي حساسة سريريا لمثبطات EGFR والتعبير العالي عن جين EGFR (البيانات غير المعروضة) لتقييم مثبطات EGFR. وقد ثبت أن حساسية RLUN007 لمثبطات EGFR كانت أعلى من تلك الأخرى المشتقة من سرطان الرئة F-PDOs13 (الشكل 4). وهكذا، فإن HTS باستخدام PDOs، التي تحتفظ بخصائص أنسجة الورم، متفوقة لتقييم العوامل المضادة المحتملة للانسان ويعرض فرصا لتقييم الأدوية والتقدم في الطب الشخصي. على الرغم من أن HTS مناسبة للفحص الأولي للعوامل ، إلا أنها لا تستنسخ البيئة الدقيقة للورم وبالتالي لا يمكنها تقييم فعالية الأدوية في الجسم الحي. لذلك ، يجري الآن تطوير نظام في المختبر يمكنه محاكاة أنسجة الورم البشري في الجسم الحي من خلال الثقافة المشتركة مع الخلايا البطانية الوعائية وغيرها من الخلايا النجمية أو تقنية الجهاز على رقاقة في غياب نماذج حيوانية.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر المرضى الذين قدموا العينات السريرية المستخدمة في هذا البحث. ويدعم هذا البحث منح من برنامج البحوث الترجمية في محافظة فوكوشيما.
Materials
| 384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate | Corning | 4516 | Plates for HTS |
| 40-µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| AdoptCell-NK kit | Kohjin Bio | 16030400 | Kit for NK cell production |
| Cancer Cell Expansion Media plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | Medium for F-PDO |
| ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | Medium for NK cells |
| CELL HANDLER | Yamaha Motor | – | Cell picking and imaging system |
| CellPet FT | JTEC | – | Cell fragmentation and dispersion equipment |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent |
| Echo 555 | Labcyte | – | Liquid handler |
| EnSpire | PerkinElmer | – | Plate reader |
| E-plate VIEW 96 | Agilent | 300601020 | Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System |
| Fibronectin Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical | 063-05591 | Plate coating for xCELLigence RTCA System |
| F-PDO | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | – | The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International |
| Morphit software, version 6.0 | The Edge Software Consultancy | Biological data analysis software | |
| Multidrop Combi | ThermoFisher Scientific | 5840300 | Cell suspension dispenser |
| Precision Chamber | Yamaha Motor | JLE9M65W230 | Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| Precision Tip | Yamaha Motor | JLE9M65W300 | Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER |
| RLUN007 | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | Lung tumor derived F-PDO | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | Cell culture dissociation reagent |
| Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask | Corning | 4616 | Culture flask for PDO |
| Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask | Corning | 3814 | Culture flask for PDO |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System | Beckman coulter | – | Cell viability analyzer |
| xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 | ACEA Bioscience | – | Analysis software for xCELLigence RTCA System |
| xCELLigence RTCA System | ACEA Bioscience | – | Electrical impedance measuring instrument for cytolysis |
Referências
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 241-253 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
- Palechor-Ceron, N., et al. Conditional reprogramming for patient-derived cancer models and next-generation living biobanks. Cells. 8 (11), 1327 (2019).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 630-643 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Inoue, A., et al. Current and future horizons of patient-derived xenograft models in colorectal cancer translational research. Cancers (Basel). 11 (9), 1321 (2019).
- Hum, N. R., et al. Comparative molecular analysis of cancer behavior cultured in vitro, in vivo, and ex vivo. Cancers (Basel). 12 (3), 690 (2020).
- Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncology Reports. 40 (2), 635-646 (2018).
- Takahashi, N., et al. An in vitro system for evaluating molecular targeted drugs using lung patient-derived tumor organoids. Cells. 8 (5), 481 (2019).
- Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
