JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Published: May 30, 2021
doi:
10.3791/62655
,
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus,The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Zaman çözümlenmiş tek moleküllü protein kaynaklı floresan geliştirme, proteinlerdeki yerel yapısal değişikliklere duyarlı yararlı bir floresan spektroskopik yakınlık sensörüdür. Burada, daha uzun menzilli FRET cetveli kullanılarak ölçüldüğünde küresel olarak yapılandırılmamış ve kararsız olarak bilinen α-Synuclein’deki kararlı yerel konformasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Abstract

Tek biyomoleküllerin ve dinamiklerinin birden fazla konformasyonunu izlemek için spektroskopik cetvellerin kullanılması, yapısal dinamiklerin anlaşılmasında ve biyolojiye katkılarında devrim yaratmasına neden oldu. FRET tabanlı cetvel 3-10 nm aralığındaki boyalar arası mesafeleri raporlarken, protein kaynaklı floresan geliştirme (PIFE) gibi diğer spektroskopik teknikler, daha kısa 0-3 nm aralığında bir boya ile protein yüzeyi arasındaki yakınlığı rapor eder. Tercih yöntemi ne olursa olsun, serbestçe dağılan biyomolekülleri teker teker ölçmedeki kullanımı, deneysel parametrenin histogramlarını alarak, her alt popülasyonun milisaniyeler içinde değişmeden kalan tek bir uyumu veya milisaniyeden çok daha hızlı bir şekilde kesişen birden fazla uyumu ve dolayısıyla ortalama bir alt popülasyonu temsil ettiği ayrı merkezi olarak dağıtılmış biyomolekül alt popülasyonlarını verir. Histogramlarda bildirilen parametrenin inter-boya FRET verimliliği olduğu tek moleküllü FRET’te, tampondaki α-Synuclein monomer gibi özünde düzensiz bir proteinin, daha önce hızla birbirine keneşen birden fazla konfektörden oluşan tek bir ortalama alt popülasyon sergilediği bildirilmiştir. Bu geçmiş bulgular FRET tabanlı cetvelin 3-10 nm aralığına bağlı olsa da, bu proteini, mekâna özgü sCy3 etiketli α-Synuclein proteinlerinin floresan ömrünü tek tek izlediğimiz tek moleküllü PIFE kullanarak test etmeye çalıştık. İlginçtir ki, bu daha kısa menzilli spektroskopik yakınlık sensörunu kullanarak, sCy3 etiketli α-Synuclein, 10-100 ms’de kesişen belirgin şekilde farklı ortalama ömürlere sahip birkaç ömür boyu alt popülasyon sergiler. Bu sonuçlar, α-Synuclein’in küresel olarak düzensiz olabileceğini, ancak yine de istikrarlı yerel yapılara sahip olduğunu göstermektedir. Özetle, bu çalışmada, yerel veya küresel yapısal değişiklikleri aynı anda bir biyomolekülden izleyen farklı spektroskopik yakınlık sensörleri kullanmanın avantajını vurguluyoruz.

Introduction

Son yirmi yılda, tek moleküllü floresan bazlı yöntemler biyomolekülleri ölçmek için güçlü bir araçhalinegelmiştir 1,2, farklı biyomoleküler parametrelerin nasıl dağılacağını ve bu parametrelerin farklı alt popülasyonları arasında milisaniyenin altında çözünürlük 3 , 4,5arasında dinamik olarak nasıl bir araya geldiklerini yoklar. Bu tekniklerdeki parametreler, FRET ölçümlerinde enerji transfer verimliliğini içerir 6,7, floresan anizotropi8,9, floresan kuantum verimleri ve ömürleri10,11, farklı floresan söndürme bir fonksiyon olarak12 veya geliştirme13 mekanizmaları. Protein kaynaklı floresan geliştirme (PIFE) 14 olarak bilinen bu mekanizmalardan biri,14, 15 , 16 ,17,18,19 boyasının çevresindeki protein yüzeylerinin neden olduğu, heyecan verici durumdayken floroforun serbest izomerizasyonunasteriktıkanıklığın bir işlevi olarak floresan kuantum veriminin ve ömrünün artırılmasınıtanıtır. . Hem FRET hem de PIFE spektroskopik cetveller veya yakınlık sensörleri olarak kabul edilir, çünkü ölçülen parametreleri ölçüm altında etiketli biyomolekül içindeki uzamsal bir ölçüye doğrudan bağlıdır. FRET verimliliği 3-10 nm20aralığındaki bir çift boya arasındaki mesafe ile ilgili olsa da, PIFE izleri floresan kuantum veriminde veya 0-3 nm19aralığındaki yakındaki bir proteinin yüzeyi arasındaki mesafe ile ilgili yaşam sürelerinde artar.

Tek moleküllü FRET, α-Synuclein (α-Syn) 22 gibi özünde düzensiz proteinler (IDP’ler)21de dahil olmak üzere birçokfarklı protein sistemine yapısal içgörüler sağlamak için yaygın olarak kullanılmıştır. α-Syn, farklı biyomoleküllere ve farklı koşullar altında 23 , 24 , 25 ,26,27,28,29,30’abağlanarak sıralı yapılar oluşturabilir. Bununla birlikte, ilişkisiz olduğunda, α-Syn monomer, hızla birbirine keneşen konformasyonlarla yüksek konformasyonlu heterojenlik ile karakterize edilir31,32.

α-Syn’nin konformasyonları daha önce, bu tür yüksek heterojen ve dinamik protein sistemlerinin konformasyonsal dinamiklerinin belirlenmesine yardımcı olan çeşitli farklı teknikler kullanılarak çalışılmıştır33,34,35,36,37,38,39. İlginçtir ki, tampondaki α-Syn’nin tek moleküllü FRET (smFRET)ölçümleri,konfokal nokta aracılığıyla α-Syn’nin tipik difüzyon zamanından çok daha hızlı zaman zaman dinamik olarak kesişen konfeksiyonların zaman ortalamasının bir sonucu olan tek bir FRET popülasyonu39,40 bildirdi (birkaç mikrosaniye kadar hızlı ve hatta bundan daha hızlı, tipik milisaniye difüzyon sürelerine göre)40, 41. Bununla birlikte, 3-10 nm mesafe hassasiyetine sahip bir FRET spektroskopik cetveli kullanmak bazen sadece α-Syn gibi küçük bir proteindeki genel yapısal değişiklikleri raporlar. Daha kısa mesafe hassasiyetlerine sahip spektroskopik yakınlık sensörlerini kullanan tek moleküllü ölçümler, yerel yapıların dinamiklerini raporlama potansiyeline sahiptir. Burada α-Syn’nin tek moleküllü PIFE ölçümlerini gerçekleştiriyor ve floresan ömürlerinin farklı alt popülasyonlarını, aralarında 100 ms kadar yavaş geçişlerle farklı yerel yapılara eşleşiyor. Bu çalışma, serbestçe dağılan α-Syn moleküllerinin zaman çözümlenmiş smPIFE ölçümlerini birer birer, tamponda ve SDS tabanlı membranlara kısa menzilli tek moleküllü spektroskopik yakınlık sensörü olarak bağlandığında özetlemektedir.

Protocol

1. Plazmid dönüşümü 0,5 L SOC ortamının hazırlanması 10 g tripton, 2,5 g Maya özü, 0,25 g sodyum klorür (NaCl), 0,1 g potasyum klorür (KCl) ağırlığındadır. Toplam 0,5 L hacme kadar çift damıtılmış su (DDW) ekleyin. Sodyum hidroksit (NaOH) ekleyerek pH 7’ye ayarlayın. 100 mL ve otoklav stok aliquots hazırlayın. Kullanmadan önce, 100 mL SOC’ye 0,5 mL steril magnezyum klorür (MgCl2)ve 1,8 mL steril glikoz ekleyin. </o…

Representative Results

Bir IDP olarak, başka bir biyomoleküle bağlı olmadığında, α-Syn, birkaç mikrosaniye40 ve hatta yüzlerce nanosaniye41’degeçişlerle birden fazla konformasyon arasında yapısal dinamikler sergiler. α-Syn konfokal noktayı geçtiğinde, konformasyonlar arasında binlerce geçişe maruz kalabilir. Gerçekten de, smFRET kullanıldığında durum böyleydi39,40. Burada α-Syn’nin yerel konformasyon dinamikler…

Discussion

α-Syn’nin yapısal özelliklerini ve düzensiz doğasını incelemek için kapsamlı biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar yapıldı33,34,35,36,37,38. Α-Syn monomerinin bağdan arındırılmış moleküler içi dinamiklerini araştırmak için birçok çalışma serbestçe dağıtıcı smFRET’i kullanmıştır. Bu çal…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PT-t7 plazmid kodlu A56C α-Syn mutant bize Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir ve Dr. Elisha Haas tarafından hediye edildi. Bu makale Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH, R01 GM130942’yi E.L.’ye subaward olarak vermek), İsrail Bilim Vakfı (KillCorona – Curbing Coronavirus Araştırma Programı dahilinde 3565/20 hibe), Milner Fonu ve Kudüs İbrani Üniversitesi (başlangıç fonları) tarafından desteklendi.

Materials

Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags – MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
  2. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  3. Haran, G. Single-molecule fluorescence spectroscopy of biomolecular folding. Journal of Physics Condensed Matter. 15 (32), R1291 (2003).
  4. Schuler, B., Lipman, E. A., Eaton, W. A. Probing the free-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy. Nature. 419 (6908), 743-747 (2002).
  5. Michalet, X., Weiss, S., Jäger, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chemical Reviews. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  6. Ha, T., Enderle, T., Ogletree, D. F., Chemla, D. S., Selvin, P. R., Weiss, S. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  7. Deniz, A. A., et al. Single-molecule protein folding: Diffusion fluorescence resonance energy transfer studies of the denaturation of chymotrypsin inhibitor 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5179-5184 (2000).
  8. Bialik, C. N., Wolf, B., Rachofsky, E. L., Ross, J. B. A., Laws, W. R. Dynamics of biomolecules: Assignment of local motions by fluorescence anisotropy decay. Biophysical Journal. 75 (5), 2564-2573 (1998).
  9. Jameson, D. M., Sawyer, W. H. Fluorescence anisotropy applied to biomolecular interactions. Methods in Enzymology. 246, 283-300 (1995).
  10. Kempe, D., Schöne, A., Fitter, J., Gabba, M. Accurate Fluorescence Quantum Yield Determination by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry B. 119 (13), 4668-4672 (2015).
  11. Callis, P. R., Liu, T. Quantitative Prediction of Fluorescence Quantum Yields for Tryptophan in Proteins. Journal of Physical Chemistry B. 108, 4248-4259 (2004).
  12. Lehrer, S. S. Solute Perturbation of Protein Fluorescence. The Quenching of the Tryptophyl Fluorescence of Model Compounds and of Lysozyme by Iodide Ion. Bioquímica. 10 (17), 3254-3263 (1971).
  13. Xie, K. X., Liu, Q., Jia, S. S., Xiao, X. X. Fluorescence enhancement by hollow plasmonic assembly and its biosensing application. Analytica Chimica Acta. 1144, 96-101 (2021).
  14. Stennett, E. M. S., Ciuba, M. A., Lin, S., Levitus, M. Demystifying PIFE: The Photophysics behind the Protein-Induced Fluorescence Enhancement Phenomenon in Cy3. Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (10), 1819-1823 (2015).
  15. Nguyen, B., Ciuba, M. A., Kozlov, A. G., Levitus, M., Lohman, T. M. Protein Environment and DNA Orientation Affect Protein-Induced Cy3 Fluorescence Enhancement. Biophysical Journal. 117 (1), 66-73 (2019).
  16. Song, D., Graham, T. G. W., Loparo, J. J. A general approach to visualize protein binding and DNA conformation without protein labelling. Nature Communications. 7, 10976 (2016).
  17. Ploetz, E., et al. Förster resonance energy transfer and protein-induced fluorescence enhancement as synergetic multi-scale molecular rulers. Scientific Reports. 6, 33257 (2016).
  18. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  19. Hwang, H., Kim, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement as a single molecule assay with short distance sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7414-7418 (2011).
  20. Ray, P. C., Fan, Z., Crouch, R. A., Sinha, S. S., Pramanik, A. Nanoscopic optical rulers beyond the FRET distance limit: Fundamentals and applications. Chemical Society Reviews. 43, 6370-6404 (2014).
  21. Chen, H., Rhoades, E. Fluorescence characterization of denatured proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (4), 516-524 (2008).
  22. Alderson, T. R., Markley, J. L. Biophysical characterization of α-synuclein and its controversial structure. Intrinsically Disordered Proteins. 1 (1), 18-39 (2013).
  23. Mane, J. Y., Stepanova, M. Understanding the dynamics of monomeric, dimeric, and tetrameric α-synuclein structures in water. FEBS Open Bio. 6 (7), 666-686 (2016).
  24. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  25. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  26. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  27. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  28. Trexler, A. J., Rhoades, E. α-Synuclein binds large unilamellar vesicles as an extended helix. Bioquímica. 48 (11), 2304-2306 (2009).
  29. Stephens, A. D., Zacharopoulou, M., Kaminski Schierle, G. S. The Cellular Environment Affects Monomeric α-Synuclein Structure. Trends in Biochemical Sciences. 44 (5), 453-466 (2019).
  30. Illes-Toth, E., Dalton, C. F., Smith, D. P. Binding of dopamine to alpha-synuclein is mediated by specific conformational states. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (9), 1346-1354 (2013).
  31. Frimpong, A. K., Abzalimov, R. R., Uversky, V. N., Kaltashov, I. A. Characterization of intrinsically disordered proteins with electrospray inization mass spectrometry: Conformationl heterogeneity of α-synuciein. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 78 (3), 714-722 (2010).
  32. Sandal, M., et al. Conformational equilibria in monomeric α-synuclein at the single-molecule level. PLoS Biology. 6 (1), e6 (2008).
  33. Brodie, N. I., Popov, K. I., Petrotchenko, E. V., Dokholyan, N. V., Borchers, C. H. Conformational ensemble of native α-synuclein in solution as determined by short-distance crosslinking constraint-guided discrete molecular dynamics simulations. PLoS Computational Biology. 15 (3), e1006859 (2019).
  34. Ullman, O., Fisher, C. K., Stultz, C. M. Explaining the structural plasticity of α-synuclein. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19536-19546 (2011).
  35. Binolfi, A., Theillet, F. X., Selenko, P. Bacterial in-cell NMR of human α-synuclein: A disordered monomer by nature?. Biochemical Society Transactions. 40 (5), 950-954 (2012).
  36. Waudby, C. A., et al. In-Cell NMR Characterization of the Secondary Structure Populations of a Disordered Conformation of α-Synuclein within E. coli Cells. PLoS ONE. 8 (8), e72286 (2013).
  37. Yu, J., Malkova, S., Lyubchenko, Y. L. α-Synuclein Misfolding: Single Molecule AFM Force Spectroscopy Study. Journal of Molecular Biology. 384 (4), 992-1001 (2008).
  38. Guerrero-Ferreira, R., Kovacik, L., Ni, D., Stahlberg, H. New insights on the structure of alpha-synuclein fibrils using cryo-electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 61, 89-95 (2020).
  39. Trexler, A. J., Rhoades, E. Single molecule characterization of α-synuclein in aggregation-prone states. Biophysical Journal. 99 (9), 3048-3055 (2010).
  40. Ferreon, A. C. M., Gambin, Y., Lemke, E. A., Deniz, A. A. Interplay of α-synuclein binding and conformational switching probed by single-molecule fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5645-5650 (2009).
  41. Rezaei-Ghaleh, N., et al. Local and Global Dynamics in Intrinsically Disordered Synuclein. Angewandte Chemie – International Edition. 57 (46), 15262-15266 (2018).
  42. Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An Open File Format for Timestamp-Based Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
  43. Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S. Y., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing Single-molecule FRET. PLoS ONE. 11 (8), e0160716 (2016).
  44. Ingargiola, A., et al. Multispot single-molecule FRET: Highthroughput analysis of freely diffusing molecules. PLoS ONE. 12 (4), e0175766 (2017).
  45. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. A. M. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  46. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102, 6601-6613 (1998).
  47. Hoffmann, A., et al. Quantifying heterogeneity and conformational dynamics from single molecule FRET of diffusing molecules: Recurrence analysis of single particles (RASP). Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (5), 1857-1871 (2011).
  48. Eakin, C. M., Berman, A. J., Miranker, A. D. A native to amyloidogenic transition regulated by a backbone trigger. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 202-208 (2006).
  49. Jahn, T. R., Parker, M. J., Homans, S. W., Radford, S. E. Amyloid formation under physiological conditions proceeds via a native-like folding intermediate. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 195-201 (2006).
  50. Chen, D., et al. Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity. Nature Communications. 10 (1), 2493 (2019).
  51. Lerner, E., Ploetz, E., Hohlbein, J., Cordes, T., Weiss, S. A Quantitative Theoretical Framework for Protein-Induced Fluorescence Enhancement-Förster-Type Resonance Energy Transfer (PIFE-FRET). Journal of Physical Chemistry. B. 120 (26), 6401-6410 (2016).
  52. Valuchova, S., Fulnecek, J., Petrov, A. P., Tripsianes, K., Riha, K. A rapid method for detecting protein-nucleic acid interactions by protein induced fluorescence enhancement. Scientific Reports. 6, 39653 (2016).
  53. Qiu, Y., Myong, S. Single-Molecule Imaging With One Color Fluorescence. Methods in Enzymology. 581, 33-51 (2016).
  54. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), eaan1133 (2018).
  55. Lerner, E., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416 (2021).
  56. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  57. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  58. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  59. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  60. Chen, J., et al. The structural heterogeneity of α-synuclein is governed by several distinct subpopulations with interconversion times slower than milliseconds. Structure. 29 (9), (2021).

Tags

Time-resolvedProtein-induced Fluorescence EnhancementSingle-moleculeAlpha-synucleinStructural SubpopulationsLocal ConformationsSulfo-Cy3BSAWater Immersion ObjectiveLaser FocusPhoton DetectionFRETBurstsPhoton-HDF5

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image