JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Använda tidsupplöst proteininducerad fluorescensförbättring för att identifiera stabila lokala konformationer en α-synukleinmonomer i taget

Published: May 30, 2021
doi:
10.3791/62655
,
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus,The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Tidsupplöst enmolekyls protein-inducerad fluorescens förbättring är en användbar fluorescens spektroskopisk närhetssensor känslig för lokala strukturella förändringar i proteiner. Här visar vi att den kan användas för att upptäcka stabila lokala konformationer i α-Synuclein, som annars kallas klotformigt ostrukturerad och instabil när den mäts med den längre räckvidden FRET-linjalen.

Abstract

Genom att använda spektroskopiska härskare för att spåra flera konformationer av enstaka biomolekyler och deras dynamik har revolutionerat förståelsen av strukturell dynamik och dess bidrag till biologin. Medan fret-baserade linjalen rapporterar om inter-dye avstånd i 3-10 nm intervallet, andra spektroskopiska tekniker, såsom protein-inducerad fluorescens förbättring (PIFE), rapportera om närheten mellan ett färgämne och en protein yta i det kortare 0-3 nm intervallet. Oavsett vilken metod man väljer, dess användning vid mätning av fritt diffuserande biomolekyler en i taget hämtar histogram av den experimentella parametern som ger separata centralt fördelade underpopulationer av biomolekyler, där varje underpopulation representerar antingen en enda konformation som förblev oförändrad inom millisekunder, eller flera konformationer som interkonverterar mycket snabbare än millisekunder, och därmed en genomsnittlig ut-ut-underpopulation. I enmolekyl fret, där den rapporterade parametern i histogram är inter-dye FRET effektivitet, en intrinsically oordnad protein, såsom α-Synuclein monomer i buffert, rapporterades tidigare som uppvisar en enda genomsnittlig ut-ut underpopulation av flera konformationer interconverting snabbt. Medan dessa tidigare resultat beror på 3-10 nm intervallet av FRET-baserade linjalen, försökte vi sätta detta protein på prov med en-molekyl PIFE, där vi spårar fluorescens livslängden för platsspecifika sCy3-märkta α-Synuclein proteiner en i taget. Intressant nog, med hjälp av denna kortare räckvidd spektroskopisk närhetssensor, sCy3-märkta α-Synuclein uppvisar flera livstidsunderpopulationer med tydligt olika genomsnittliga livslängder som interkonverteras i 10-100 ms. Dessa resultat visar att även om α-Synuclein kan vara oordnad globalt, uppnår det ändå stabila lokala strukturer. Sammanfattningsvis lyfter vi i detta arbete fram fördelen med att använda olika spektroskopiska närhetssensorer som spårar lokala eller globala strukturella förändringar en biomolekyl i taget.

Introduction

Under de senaste två decennierna har fluorescensbaserade metoder med en molekyl blivit ett kraftfullt verktyg för att mäta biomolekyler1,2, som undersöker hur olika biomolekylära parametrar fördelar samt hur de dynamiskt interkonverterar mellan olika underpopulationer av dessa parametrar vid sub millisekundsupplösning3,4,5. Parametrarna i dessa tekniker inkluderar energiöverföringseffektiviteten i FRET-mätningar 6,7, fluorescensanisotropi8,9, fluorescenskvantutbyten ochlivstider 10,11, som en funktion av olika fluorescenssläckning12 eller förbättring13 mekanismer. En av dessa mekanismer, mer känd som proteininducerad fluorescensförbättring (PIFE)14 introducerar förbättringen av fluorescenskvantutbyte och livslängd som en funktion av sterisk obstruktion av fluoroforens fria isomerisering när den är i upphetsad tillstånd, orsakad av proteinytor i närheten av färgämnet14,15,16,17,18,19 . Både FRET och PIFE betraktas som spektroskopiska linjaler eller närhetssensorer eftersom deras uppmätta parameter är direkt kopplad till ett rumsligt mått inom den märkta biomolekylen under mätning. Medan FRET-effektiviteten är relaterad till avståndet mellan ett par färgämnen inom ett intervall av 3-10 nm20,ökar PIFE-spåren i fluorescenskvantutbyten eller livstider relaterade till avståndet mellan färgämnet och en yta av ett närliggande protein i intervallet 0-3 nm19.

Enmolekyliga FRET har använts i stor utsträckning för att ge strukturella insikter i många olika proteinsystem, inklusive inneboende oordnade proteiner (IDPs)21, såsom α-Synuclein (α-Syn)22. α-Syn kan bilda beställda strukturer efter bindning till olika biomolekyler och under olika förhållanden23,24,25,26,27,28,29,30. Men när den är obunden kännetecknas α-Syn-monomeren av hög konformations heterogenitet med snabbt interkonverterande konformationer31,32.

Konformationerna av α-Syn har tidigare studerats med hjälp av olika tekniker som hjälper till att identifiera konformationsdynamiken hos sådana mycket heterogena och dynamiska proteinsystem33,34,35,36,37,38,39. Intressant nog rapporterade enstaka molekyl FRET (smFRET) mätningar av α-Syn i buffert en enda FRET-population39,40 som är ett resultat av tidsgenomsättning av konformationer dynamiskt interkonverterande ibland mycket snabbare än den typiska diffusionstiden för α-Syn genom den konfokala punkten (gånger så snabbt som några mikrosekunder och till och med snabbare än så, i förhållande till typiska millisekunds diffusionstider)40, 41. Men med hjälp av en FRET spektroskopisk linjal med 3-10 nm avståndskänslighet rapporterar ibland endast om övergripande strukturella förändringar i ett litet protein som α-Syn. Enmolekylsmätningar med hjälp av spektroskopiska närhetssensorer med kortare avståndskänslighet har potential att rapportera om dynamiken i lokala strukturer. Häri utför vi pife-mätningar med en molekyl av α-Syn och identifierar olika underpopulationer av fluorescenslivslängder som kartlägger olika lokala strukturer med övergångar mellan dem så långsamma som 100 ms. Detta arbete sammanfattar tidsupplösta smPIFE-mätningar av fritt diffuserande α-Syn-molekyler en i taget, i buffert och när den är bunden till SDS-baserade membran som en kortdistans enmolekyls spektroskopisk närhetssensor.

Protocol

1. Plasmid omvandling Beredning av 0,5 L SOC-medium Väg 10 g trypton, 2,5 g jästextrakt, 0,25 g natriumklorid (NaCl), 0,1 g kaliumklorid (KCl). Tillsätt dubbeldestillerat vatten (DDW) tills den totala volymen 0,5 L. Justera till pH 7 genom att tillsätta natriumhydroxid (NaOH). Förbered lager aliquots på 100 mL och autoklav. Tillsätt 0,5 ml steril magnesiumklorid (MgCl2)och 1,8 ml steril glukos till 100 ml SOC innan användning. </…

Representative Results

Som en IDP, när den inte är bunden till en annan biomolekyl, uppvisar α-Syn strukturell dynamik mellan flera konformationer, med övergångar vid några mikrosekunder40 och till och med vid hundratals nanosekunder41. När α-Syn korsar den konfokala platsen kan den genomgå tusentals övergångar mellan konformationer. Detta var faktiskt fallet när smFRET användes39,40. Här utför vi smPIFE-mätningar för att…

Discussion

Omfattande biokemiska och biofysiska studier utfördes för att studera de strukturella egenskaperna hos α-Syn och dess oordnade natur33,34,35,36,37,38. Flera verk har redan använt fritt diffuserande smFRET för att undersöka den intramolekylära dynamiken hos α-Syn-monomer fri från bindning. Dessa arbeten rapporterade d…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PT-t7 plasmid kodning A56C α-Syn mutant gavs till oss som en present från Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir och Dr. Elisha Haas. Detta dokument stöddes av National Institutes of Health (NIH, anslag R01 GM130942 till E.L. som subaward), Israel Science Foundation (anslag 3565/20 inom KillCorona – Curbing Coronavirus Research Program), Milner Fund och Hebrew University of Jerusalem (startup funds).

Materials

Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags – MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
  2. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  3. Haran, G. Single-molecule fluorescence spectroscopy of biomolecular folding. Journal of Physics Condensed Matter. 15 (32), R1291 (2003).
  4. Schuler, B., Lipman, E. A., Eaton, W. A. Probing the free-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy. Nature. 419 (6908), 743-747 (2002).
  5. Michalet, X., Weiss, S., Jäger, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chemical Reviews. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  6. Ha, T., Enderle, T., Ogletree, D. F., Chemla, D. S., Selvin, P. R., Weiss, S. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  7. Deniz, A. A., et al. Single-molecule protein folding: Diffusion fluorescence resonance energy transfer studies of the denaturation of chymotrypsin inhibitor 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5179-5184 (2000).
  8. Bialik, C. N., Wolf, B., Rachofsky, E. L., Ross, J. B. A., Laws, W. R. Dynamics of biomolecules: Assignment of local motions by fluorescence anisotropy decay. Biophysical Journal. 75 (5), 2564-2573 (1998).
  9. Jameson, D. M., Sawyer, W. H. Fluorescence anisotropy applied to biomolecular interactions. Methods in Enzymology. 246, 283-300 (1995).
  10. Kempe, D., Schöne, A., Fitter, J., Gabba, M. Accurate Fluorescence Quantum Yield Determination by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry B. 119 (13), 4668-4672 (2015).
  11. Callis, P. R., Liu, T. Quantitative Prediction of Fluorescence Quantum Yields for Tryptophan in Proteins. Journal of Physical Chemistry B. 108, 4248-4259 (2004).
  12. Lehrer, S. S. Solute Perturbation of Protein Fluorescence. The Quenching of the Tryptophyl Fluorescence of Model Compounds and of Lysozyme by Iodide Ion. Bioquímica. 10 (17), 3254-3263 (1971).
  13. Xie, K. X., Liu, Q., Jia, S. S., Xiao, X. X. Fluorescence enhancement by hollow plasmonic assembly and its biosensing application. Analytica Chimica Acta. 1144, 96-101 (2021).
  14. Stennett, E. M. S., Ciuba, M. A., Lin, S., Levitus, M. Demystifying PIFE: The Photophysics behind the Protein-Induced Fluorescence Enhancement Phenomenon in Cy3. Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (10), 1819-1823 (2015).
  15. Nguyen, B., Ciuba, M. A., Kozlov, A. G., Levitus, M., Lohman, T. M. Protein Environment and DNA Orientation Affect Protein-Induced Cy3 Fluorescence Enhancement. Biophysical Journal. 117 (1), 66-73 (2019).
  16. Song, D., Graham, T. G. W., Loparo, J. J. A general approach to visualize protein binding and DNA conformation without protein labelling. Nature Communications. 7, 10976 (2016).
  17. Ploetz, E., et al. Förster resonance energy transfer and protein-induced fluorescence enhancement as synergetic multi-scale molecular rulers. Scientific Reports. 6, 33257 (2016).
  18. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  19. Hwang, H., Kim, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement as a single molecule assay with short distance sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7414-7418 (2011).
  20. Ray, P. C., Fan, Z., Crouch, R. A., Sinha, S. S., Pramanik, A. Nanoscopic optical rulers beyond the FRET distance limit: Fundamentals and applications. Chemical Society Reviews. 43, 6370-6404 (2014).
  21. Chen, H., Rhoades, E. Fluorescence characterization of denatured proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (4), 516-524 (2008).
  22. Alderson, T. R., Markley, J. L. Biophysical characterization of α-synuclein and its controversial structure. Intrinsically Disordered Proteins. 1 (1), 18-39 (2013).
  23. Mane, J. Y., Stepanova, M. Understanding the dynamics of monomeric, dimeric, and tetrameric α-synuclein structures in water. FEBS Open Bio. 6 (7), 666-686 (2016).
  24. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  25. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  26. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  27. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  28. Trexler, A. J., Rhoades, E. α-Synuclein binds large unilamellar vesicles as an extended helix. Bioquímica. 48 (11), 2304-2306 (2009).
  29. Stephens, A. D., Zacharopoulou, M., Kaminski Schierle, G. S. The Cellular Environment Affects Monomeric α-Synuclein Structure. Trends in Biochemical Sciences. 44 (5), 453-466 (2019).
  30. Illes-Toth, E., Dalton, C. F., Smith, D. P. Binding of dopamine to alpha-synuclein is mediated by specific conformational states. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (9), 1346-1354 (2013).
  31. Frimpong, A. K., Abzalimov, R. R., Uversky, V. N., Kaltashov, I. A. Characterization of intrinsically disordered proteins with electrospray inization mass spectrometry: Conformationl heterogeneity of α-synuciein. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 78 (3), 714-722 (2010).
  32. Sandal, M., et al. Conformational equilibria in monomeric α-synuclein at the single-molecule level. PLoS Biology. 6 (1), e6 (2008).
  33. Brodie, N. I., Popov, K. I., Petrotchenko, E. V., Dokholyan, N. V., Borchers, C. H. Conformational ensemble of native α-synuclein in solution as determined by short-distance crosslinking constraint-guided discrete molecular dynamics simulations. PLoS Computational Biology. 15 (3), e1006859 (2019).
  34. Ullman, O., Fisher, C. K., Stultz, C. M. Explaining the structural plasticity of α-synuclein. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19536-19546 (2011).
  35. Binolfi, A., Theillet, F. X., Selenko, P. Bacterial in-cell NMR of human α-synuclein: A disordered monomer by nature?. Biochemical Society Transactions. 40 (5), 950-954 (2012).
  36. Waudby, C. A., et al. In-Cell NMR Characterization of the Secondary Structure Populations of a Disordered Conformation of α-Synuclein within E. coli Cells. PLoS ONE. 8 (8), e72286 (2013).
  37. Yu, J., Malkova, S., Lyubchenko, Y. L. α-Synuclein Misfolding: Single Molecule AFM Force Spectroscopy Study. Journal of Molecular Biology. 384 (4), 992-1001 (2008).
  38. Guerrero-Ferreira, R., Kovacik, L., Ni, D., Stahlberg, H. New insights on the structure of alpha-synuclein fibrils using cryo-electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 61, 89-95 (2020).
  39. Trexler, A. J., Rhoades, E. Single molecule characterization of α-synuclein in aggregation-prone states. Biophysical Journal. 99 (9), 3048-3055 (2010).
  40. Ferreon, A. C. M., Gambin, Y., Lemke, E. A., Deniz, A. A. Interplay of α-synuclein binding and conformational switching probed by single-molecule fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5645-5650 (2009).
  41. Rezaei-Ghaleh, N., et al. Local and Global Dynamics in Intrinsically Disordered Synuclein. Angewandte Chemie – International Edition. 57 (46), 15262-15266 (2018).
  42. Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An Open File Format for Timestamp-Based Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
  43. Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S. Y., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing Single-molecule FRET. PLoS ONE. 11 (8), e0160716 (2016).
  44. Ingargiola, A., et al. Multispot single-molecule FRET: Highthroughput analysis of freely diffusing molecules. PLoS ONE. 12 (4), e0175766 (2017).
  45. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. A. M. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  46. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102, 6601-6613 (1998).
  47. Hoffmann, A., et al. Quantifying heterogeneity and conformational dynamics from single molecule FRET of diffusing molecules: Recurrence analysis of single particles (RASP). Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (5), 1857-1871 (2011).
  48. Eakin, C. M., Berman, A. J., Miranker, A. D. A native to amyloidogenic transition regulated by a backbone trigger. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 202-208 (2006).
  49. Jahn, T. R., Parker, M. J., Homans, S. W., Radford, S. E. Amyloid formation under physiological conditions proceeds via a native-like folding intermediate. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 195-201 (2006).
  50. Chen, D., et al. Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity. Nature Communications. 10 (1), 2493 (2019).
  51. Lerner, E., Ploetz, E., Hohlbein, J., Cordes, T., Weiss, S. A Quantitative Theoretical Framework for Protein-Induced Fluorescence Enhancement-Förster-Type Resonance Energy Transfer (PIFE-FRET). Journal of Physical Chemistry. B. 120 (26), 6401-6410 (2016).
  52. Valuchova, S., Fulnecek, J., Petrov, A. P., Tripsianes, K., Riha, K. A rapid method for detecting protein-nucleic acid interactions by protein induced fluorescence enhancement. Scientific Reports. 6, 39653 (2016).
  53. Qiu, Y., Myong, S. Single-Molecule Imaging With One Color Fluorescence. Methods in Enzymology. 581, 33-51 (2016).
  54. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), eaan1133 (2018).
  55. Lerner, E., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416 (2021).
  56. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  57. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  58. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  59. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  60. Chen, J., et al. The structural heterogeneity of α-synuclein is governed by several distinct subpopulations with interconversion times slower than milliseconds. Structure. 29 (9), (2021).

Tags

Time-resolvedProtein-induced Fluorescence EnhancementSingle-moleculeAlpha-synucleinStructural SubpopulationsLocal ConformationsSulfo-Cy3BSAWater Immersion ObjectiveLaser FocusPhoton DetectionFRETBurstsPhoton-HDF5

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image