Under de senaste två decennierna har fluorescensbaserade metoder med en molekyl blivit ett kraftfullt verktyg för att mäta biomolekyler^1,2, som undersöker hur olika biomolekylära parametrar fördelar samt hur de dynamiskt interkonverterar mellan olika underpopulationer av dessa parametrar vid sub millisekundsupplösning^3,4,5. Parametrarna i dessa tekniker inkluderar energiöverföringseffektiviteten i FRET-mätningar ⁶,⁷, fluorescensanisotropi^8,9, fluorescenskvantutbyten och^{livstider 10,11}, som en funktion av olika fluorescenssläckning¹² eller förbättring¹³ mekanismer. En av dessa mekanismer, mer känd som proteininducerad fluorescensförbättring (PIFE)¹⁴ introducerar förbättringen av fluorescenskvantutbyte och livslängd som en funktion av sterisk obstruktion av fluoroforens fria isomerisering när den är i upphetsad tillstånd, orsakad av proteinytor i närheten av färgämnet^{14,15,16,17,18,19} . Både FRET och PIFE betraktas som spektroskopiska linjaler eller närhetssensorer eftersom deras uppmätta parameter är direkt kopplad till ett rumsligt mått inom den märkta biomolekylen under mätning. Medan FRET-effektiviteten är relaterad till avståndet mellan ett par färgämnen inom ett intervall av 3-10 nm^20,ökar PIFE-spåren i fluorescenskvantutbyten eller livstider relaterade till avståndet mellan färgämnet och en yta av ett närliggande protein i intervallet 0-3 nm¹⁹.

Enmolekyliga FRET har använts i stor utsträckning för att ge strukturella insikter i många olika proteinsystem, inklusive inneboende oordnade proteiner (IDPs)²¹, såsom α-Synuclein (α-Syn)²². α-Syn kan bilda beställda strukturer efter bindning till olika biomolekyler och under olika förhållanden^{23,24,25,26,27,28,29,30}. Men när den är obunden kännetecknas α-Syn-monomeren av hög konformations heterogenitet med snabbt interkonverterande konformationer^31,32.

Konformationerna av α-Syn har tidigare studerats med hjälp av olika tekniker som hjälper till att identifiera konformationsdynamiken hos sådana mycket heterogena och dynamiska proteinsystem^{33,34,35,36,37,38,39}. Intressant nog rapporterade enstaka molekyl FRET (smFRET) mätningar av α-Syn i buffert en enda FRET-population^39,40 som är ett resultat av tidsgenomsättning av konformationer dynamiskt interkonverterande ibland mycket snabbare än den typiska diffusionstiden för α-Syn genom den konfokala punkten (gånger så snabbt som några mikrosekunder och till och med snabbare än så, i förhållande till typiska millisekunds diffusionstider)^{40, 41}. Men med hjälp av en FRET spektroskopisk linjal med 3-10 nm avståndskänslighet rapporterar ibland endast om övergripande strukturella förändringar i ett litet protein som α-Syn. Enmolekylsmätningar med hjälp av spektroskopiska närhetssensorer med kortare avståndskänslighet har potential att rapportera om dynamiken i lokala strukturer. Häri utför vi pife-mätningar med en molekyl av α-Syn och identifierar olika underpopulationer av fluorescenslivslängder som kartlägger olika lokala strukturer med övergångar mellan dem så långsamma som 100 ms. Detta arbete sammanfattar tidsupplösta smPIFE-mätningar av fritt diffuserande α-Syn-molekyler en i taget, i buffert och när den är bunden till SDS-baserade membran som en kortdistans enmolekyls spektroskopisk närhetssensor.