Utilizando o aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas resolvidas pelo tempo para identificar conformações locais estáveis Um monômero α-sinucleína de cada vez

Nas últimas duas décadas, os métodos baseados em fluorescência de moléculas únicas tornaram-se uma poderosa ferramenta para medir biomoléculas^1,2, sondando como diferentes parâmetros biomoleculares se distribuem, bem como como eles interconvertem dinamicamente entre diferentes subpopulgências desses parâmetros na resolução sub-milissegundo^3,4,5. Os parâmetros nestas técnicas incluem a eficiência da transferência de energia nas medições de FRET ^6,7, anisotropia de fluorescência^8,9, rendimentos quânticos de fluorescência e vidas^10,11, em função de diferentes mecanismos de fluorescência que saciem¹² ou aprimoramento¹³ mecanismos. Um desses mecanismos, mais conhecido como aumento da fluorescência induzida por proteínas (PIFE)¹⁴ introduz o aprimoramento do rendimento quântico da fluorescência e da vida como uma função da obstrução estérica à isomerização livre do fluorohore quando em estado animado, causado por superfícies proteicas nas proximidades do corante^{14,15,16,17,18,19} . Tanto o FRET quanto o PIFE são considerados governantes espectroscópicos ou sensores de proximidade, uma vez que seu parâmetro medido está diretamente ligado a uma medida espacial dentro da biomolécula rotulada sob medição. Enquanto a eficiência do FRET está relacionada à distância entre um par de corantes dentro de uma faixa de 3-10 nm^20,o PIFE rastreia aumentos nos rendimentos quânticos da fluorescência ou vidas relacionadas à distância entre o corante e uma superfície de uma proteína próxima na faixa de 0-3 nm¹⁹.

O FRET de molécula única tem sido amplamente utilizado para fornecer insights estruturais em muitos sistemas proteicos diferentes, incluindo proteínas intrinsecamente desordenadas (IDPs)²¹, como α-Synuclein (α-Syn)²². α-Syn pode formar estruturas ordenadas seguindo a ligação a diferentes biomoléculas e em diferentes condições^{23,24,25,26,27,28,29,30}. No entanto, quando desvinculado, o monômero α-Syn é caracterizado por alta heterogeneidade conformacional com conformações rapidamente interconversas^31,32.

As conformações de α-Syn têm sido estudadas anteriormente utilizando-se de diversas técnicas diferentes que ajudam na identificação da dinâmica conformacional de sistemas tão heterogêneos e dinâmicos^{33,34,35,36,37,38,39}. Curiosamente, as medições de FRET (smFRET) de molécula única de α-Syn no buffer relataram uma única população de FRET^39,40 que é um resultado da média de tempo de conformações interconvertidas dinamicamente às vezes muito mais rápido do que o tempo típico de difusão de α-Syn através do ponto confocal (vezes tão rápido quanto poucos microssegundos e ainda mais rápido do que isso, em relação aos tempos típicos de difusão de milissegundos)^{40, 41}. No entanto, o uso de uma régua espectroscópica FRET com a sensibilidade à distância de 3-10 nm às vezes relata apenas mudanças estruturais globais em uma pequena proteína, como α-Syn. Medições de molécula única utilizando sensores de proximidade espectroscópicos com sensibilidades de distância mais curta têm o potencial de relatar a dinâmica das estruturas locais. Aqui realizamos medições pife de molécula única de α-Syn e identificamos diferentes subsu populações de vida fluorescência mapeando para diferentes estruturas locais com transições entre elas tão lentas quanto 100 ms. Este trabalho resume as medidas smPIFE resolvidas pelo tempo de moléculas α-Syn livremente difundidas uma de cada vez, em buffer e quando ligadas a membranas baseadas em SDS como um sensor de proximidade espectroscópico de molécula única de curto alcance.