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Bioquímica

Utilisation de l’amélioration de la fluorescence induite par les protéines résolues dans le temps pour identifier les conformations locales stables un α-synucléine à la fois

Published: May 30, 2021
doi:
10.3791/62655
,
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus,The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

L’amélioration de la fluorescence induite par une seule molécule résolue dans le temps est un capteur de proximité spectroscopique de fluorescence utile sensible aux changements structurels locaux dans les protéines. Ici, nous montrons qu’il peut être utilisé pour découvrir des conformations locales stables dans la α-synucléine, qui est également connue sous le nom de non structurée globulaire et instable lorsqu’elle est mesurée à l’aide de la règle FRET à plus longue portée.

Abstract

L’utilisation de règles spectroscopiques pour suivre les conformations multiples de biomolécules uniques et leur dynamique a révolutionné la compréhension de la dynamique structurelle et de ses contributions à la biologie. Alors que la règle basée sur FRET rend compte des distances inter-colorants dans la gamme 3-10 nm, d’autres techniques spectroscopiques, telles que l’amélioration de la fluorescence induite par les protéines (PIFE), rapportent la proximité entre un colorant et une surface protéique dans la gamme plus courte de 0-3 nm. Quelle que soit la méthode de choix, son utilisation dans la mesure de biomolécules à diffusion libre une à la fois récupère des histogrammes du paramètre expérimental donnant des sous-populations de biomolécules distinctes distribuées centralement, où chaque sous-population représente soit une seule conformation qui est restée inchangée en quelques millisecondes, soit plusieurs conformations qui s’interconvertissent beaucoup plus rapidement que les millisecondes, et donc une sous-population moyenne. Dans fret à molécule unique, où le paramètre rapporté dans les histogrammes est l’efficacité FRET inter-colorant, une protéine intrinsèquement désordonnée, telle que le monomère α-synucléine dans le tampon, a déjà été signalée comme présentant une seule sous-population moyenne de conformations multiples s’interconvertissant rapidement. Bien que ces résultats antérieurs dépendent de la plage de 3 à 10 nm de la règle basée sur FRET, nous avons cherché à tester cette protéine à l’aide de PIFE à molécule unique, où nous suivons la durée de vie de fluorescence des protéines de α-synucléine marquées sCy3 spécifiques au site, une à la fois. Fait intéressant, en utilisant ce capteur de proximité spectroscopique à plus courte portée, la α-synucléine marqué sCy3 présente plusieurs sous-populations de vie avec des durées de vie moyennes distinctement différentes qui s’interconvertissent en 10-100 ms. Ces résultats montrent que si la α-synucléine peut être désordonnée à l’échelle mondiale, elle atteint néanmoins des structures locales stables. En résumé, dans ce travail, nous soulignons l’avantage d’utiliser différents capteurs de proximité spectroscopiques qui suivent les changements structurels locaux ou globaux une biomolécule à la fois.

Introduction

Au cours des deux dernières décennies, les méthodes basées sur la fluorescence à molécule unique sont devenues un outil puissant pour mesurer les biomolécules1,2, sondant comment les différents paramètres biomoléculaires se distribuent ainsi que comment ils s’interconvertissent dynamiquement entre différentes sous-populations de ces paramètres à une résolution inférieure à la milliseconde3,4,5. Les paramètres de ces techniques comprennent l’efficacité de transfert d’énergie dans les mesures FRET 6,7, l’anisotropie de fluorescence8,9, les rendements quantiques de fluorescence et les durées de vie10,11, en fonction de différents mécanismes de trempe de fluorescence12 ou d’amélioration13. L’un de ces mécanismes, mieux connu sous le nom d’amélioration de la fluorescence induite par les protéines (PIFE)14 introduit l’amélioration du rendement quantique de fluorescence et de la durée de vie en fonction de l’obstruction stérique à l’isomérisation libre du fluorophore à l’état excité, causée par des surfaces protéiques au voisinage du colorant14,15, 16,17,18,19 . Fret et PIFE sont considérés comme des règles spectroscopiques ou des capteurs de proximité puisque leur paramètre mesuré est directement lié à une mesure spatiale au sein de la biomolécule étiquetée sous mesure. Alors que l’efficacité FRET est liée à la distance entre une paire de colorants dans une plage de 3-10 nm20, PIFE suit des augmentations dans les rendements quantiques de fluorescence ou les durées de vie liées à la distance entre le colorant et une surface d’une protéine voisine dans la gamme de 0-3 nm19.

Fret mono-molécule a été largement utilisé pour fournir des informations structurelles sur de nombreux systèmes protéiques différents, y compris les protéines intrinsèquement désordonnées (IDP)21, telles que α-Synucléine (α-Syn)22. α-Syn peut former des structures ordonnées suite à la liaison à différentes biomolécules et dans différentes conditions23,24,25,26,27,28,29,30. Cependant, lorsqu’il n’est pas lié, le monomère α-Syn est caractérisé par une hétérogénéité conformationnelle élevée avec des conformations d’interconversion rapide31,32.

Les conformations de α-Syn ont été étudiées précédemment en utilisant différentes techniques qui aident à identifier la dynamique conformationnelle de ces systèmes protéiques hautement hétérogènes et dynamiques33,34 , 35,36,37,38,39. Fait intéressant, les mesures FRET (smFRET) à molécule unique de α-Syn dans le tampon ont rapporté une seule population FRET39,40 qui est le résultat de la moyenne temporelle des conformations s’interconvertissant dynamiquement à des moments beaucoup plus rapides que le temps de diffusion typique de α-Syn à travers la tache confocale (des fois aussi rapide que quelques microsecondes et même plus rapide que cela, par rapport aux temps de diffusion typiques de la milliseconde)40, 41. Cependant, l’utilisation d’une règle spectroscopique FRET avec la sensibilité de distance de 3 à 10 nm ne rapporte parfois que les changements structurels globaux dans une petite protéine telle que α-Syn. Les mesures à molécule unique utilisant des capteurs de proximité spectroscopiques avec des sensibilités de distance plus courtes ont le potentiel de rendre compte de la dynamique des structures locales. Ici, nous effectuons des mesures PIFE monomoléculeuses de α-Syn et identifions différentes sous-populations de durées de vie de fluorescence mappant à différentes structures locales avec des transitions entre elles aussi lentes que 100 ms. Ce travail résume les mesures smPIFE résolues dans le temps de molécules de α-Syn à diffusion libre une à la fois, dans un tampon et lorsqu’elles sont liées à des membranes à base de SDS en tant que capteur de proximité spectroscopique à molécule unique à courte portée.

Protocol

1. Transformation plasmidique Préparation de 0,5 L de milieu SOC Peser 10 g de tryptone, 2,5 g d’extrait de levure, 0,25 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,1 g de chlorure de potassium (KCl). Ajouter l’eau double distillée (DDW) jusqu’à un volume total de 0,5 L. Ajuster au pH 7 en ajoutant de l’hydroxyde de sodium (NaOH). Préparer des aliquotes de stock de 100 mL et autoclave. Avant utilisation, ajouter 0,5 mL de chlorure de magnésium stérile…

Representative Results

En tant que PDI, lorsqu’il n’est pas lié à une autre biomolécule, α-Syn présente une dynamique structurelle entre de multiples conformations, avec des transitions à quelques microsecondes40 et même à des centaines de nanosecondes41. Lorsque α-Syn traverse la tache confocale, il peut subir des milliers de transitions entre les conformations. En effet, ce fut le cas lorsque smFRET était utilisé39,40. Ic…

Discussion

Des études biochimiques et biophysiques approfondies ont été réalisées pour étudier les caractéristiques structurelles de α-Syn et sa nature désordonnée33,34,35,36,37,38. Plusieurs travaux ont déjà utilisé le smFRET à diffusion libre pour étudier la dynamique intramoléculaire du monomère α-Syn exempt de liai…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le mutant plasmidique pT-t7 acodant A56C α-Syn nous a été remis en cadeau par le Dr Asaf Grupi, le Dr Dan Amir et le Dr Elisha Haas. Cet article a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH, subvention R01 GM130942 à E.L. en tant que sous-prix), la Fondation israélienne pour la science (subvention 3565/20 dans le cadre du programme de recherche KillCorona – Curbing Coronavirus), le Fonds Milner et l’Université hébraïque de Jérusalem (fonds de démarrage).

Materials

Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags – MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625
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Referências

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Time-resolvedProtein-induced Fluorescence EnhancementSingle-moleculeAlpha-synucleinStructural SubpopulationsLocal ConformationsSulfo-Cy3BSAWater Immersion ObjectiveLaser FocusPhoton DetectionFRETBurstsPhoton-HDF5

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Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).
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