Implantatie van een schedelvenster voor herhaalde in vivo beeldvorming bij wakkere muizen
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een chronisch schedelvenster voor de longitudinale beeldvorming van hersencellen in wakkere, hoofdbezorgde muizen.
Abstract
Om de cellulaire fysiologie van neuronen en glia bij zich gedragende dieren volledig te begrijpen, is het noodzakelijk om hun morfologie te visualiseren en hun activiteit in vivo vast te leggen bij zich gedragende muizen. Dit artikel beschrijft een methode voor de implantatie van een chronisch schedelvenster om de longitudinale beeldvorming van hersencellen in wakkere, hoofdbevangen muizen mogelijk te maken. In combinatie met genetische strategieën en virale injecties is het mogelijk om specifieke cellen en interessante gebieden te labelen met structurele of fysiologische markers. Dit protocol laat zien hoe virale injecties kunnen worden gecombineerd om neuronen in de buurt van GCaMP6-tot expressie brengende astrocyten in de cortex te labelen voor gelijktijdige beeldvorming van beide cellen door een schedelvenster. Multifoton beeldvorming van dezelfde cellen kan dagen, weken of maanden worden uitgevoerd bij wakkere, zich gedragende dieren. Deze aanpak biedt onderzoekers een methode om cellulaire dynamica in realtime te bekijken en kan worden toegepast om een aantal vragen in de neurowetenschappen te beantwoorden.
Introduction
Het vermogen om in vivo multifotonenfluorescentiemicroscopie uit te voeren in de cortex van muizen is van het grootste belang voor de studie van cellulaire signalering en structuur 1,2,3,4,5,6,7,8,9, ziektepathologie 10,11 en cellulaire ontwikkeling12,13 . Met de implantatie van chronische schedelvensters is longitudinale beeldvorming mogelijk, waardoor herhaalde beeldvorming van corticale gebieden gedurende dagen, weken of maanden mogelijk is13,14 bij levende dieren. Multifotonenmicroscopie is ideaal voor in vivo, herhaalde beeldvorming vanwege verbeterde diepte-tastering en verminderde fotoschade in verband met de gebruikte infraroodlaser. Dit maakt de studie van moleculaire en cellulaire dynamica van specifieke cellen in verschillende corticale regio’s mogelijk.
Multifotonenmicroscopie is gebruikt voor in vivo beeldvorming van neuronale en gliacellen bij muizen 15,16,17,18,19,20. Verschillende strategieën kunnen worden geïmplementeerd om bepaalde celtypen en interessegebieden te labelen. Een veel voorkomende aanpak is om de expressie van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten op een celspecifieke manier te stimuleren met behulp van het Cre-Lox-recombinatiesysteem. Dit kan worden uitgevoerd met genetisch gemodificeerde muizen, bijvoorbeeld het kruisen van tdTomato “floxed” muis (Ai14) met een muis die Cre-recombinase tot expressie brengt onder een promotor van belang21. Als alternatief kan cel- en plaatsspecifieke etikettering worden bereikt met virale injecties. Hier worden een virus dat codeert voor Cre-recombinase onder een celspecifieke promotor en een virus dat codeert voor een gevlokt gen van belang geïnjecteerd in een gedefinieerd gebied. Geschikte celtypen die beide virale vectoren ontvangen, zullen dan het gewenste gen (en) tot expressie brengen. Deze genen kunnen structurele markers zijn, zoals tdTomato, om veranderingen in cellulaire morfologie22 of genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI’s), zoals GCaMP en / of RCaMP, te bekijken om calciumdynamiek23 te onderzoeken. Methoden van genetische recombinatie kunnen individueel of in combinatie worden toegepast om een of meer celtypen te labelen. Een derde benadering, waarvoor geen transgene muizen of virale constructies (die een beperkte verpakkingscapaciteit hebben) nodig zijn, is in utero-elektroporatie van DNA-constructen24. Afhankelijk van de timing van de elektroporatie kunnen verschillende celtypen worden gericht op 25,26,27.
Bij het uitvoeren van multifoton-beeldvorming kunnen muizen worden afgebeeld terwijl ze wakker zijn of verdoofd. Beeldvorming van wakkere muizen kan worden uitgevoerd door de muis vast te zetten via een bevestigde kopplaat28. Deze aanpak wordt minder stressvol gemaakt door relatief vrije beweging van het dier mogelijk te maken met behulp van methoden, zoals vrij zwevende, luchtondersteunde piepschuimballen29, vrij zwevende loopbanden1, of een luchtgelift thuiskooisysteem waarbij muizen worden vastgemaakt door een bevestigde hoofdplaat en mogen bewegen in een open kamer30. Voor elk van deze beeldvormingscondities zal het eerst nodig zijn om de muizen te laten wennen aan de beeldvormingsopstelling. Dit artikel beschrijft de gewennings- en beeldvormingsprocedure met behulp van een luchtgelift thuiskooisysteem.
Dit protocol beschrijft de implantatie van een chronisch schedelvenster voor longitudinale in vivo beeldvorming in de cortex. Hier zullen we muizen gebruiken die GCaMP6f voorwaardelijk tot expressie brengen in astrocyten om de dynamiek van calciumsignalering te volgen. Verder beschrijft dit artikel de procedure voor virale injecties met tdTomato als een label voor neuronen. Dit maakt het mogelijk om veranderingen in de neuronale synaptische structuur te bepalen en /of de beschikbaarheid als een structurele marker die herhaalde beeldvorming van dezelfde astrocyte mogelijk maakt. Gedurende het hele protocol zullen cruciale stappen worden gemarkeerd om de best mogelijke kwaliteit van beelden verkregen uit multifotonenmicroscopie te garanderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we een protocol gepresenteerd voor de implantatie van chronische schedelvensters voor in vivo beeldvorming van corticale astrocyten en neuronen in wakkere, hoofdbezorgde muizen op een luchtgelifte thuiskooi. Er zijn specifieke voorbeelden gegeven van de craniale venstertoepassing voor het afbeelden van astrocyten die GECI’s en neuronale synaptische structuren tot expressie brengen. Met behulp van multifotonenmicroscopie kunnen astrocytische calciumsignaleringsdynamiek en structurele synaptische dynam…
Materials
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
Referências
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium–implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer’s disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
