在小鼠皮层中进行体内多光子荧光显微镜检查的能力对于研究细胞信号传导和结构^1，2，^{3，4，5，6，7，8，9}，疾病病理学^10，11和细胞发育^12，13至关重要.通过植入慢性颅窗，可以进行纵向成像，允许在活体动物中对皮质区域进行数天，数周或数月^13，14的重复成像。多光子显微镜是体内重复成像的理想选择，因为改进了深度探测，减少了与所用红外激光相关的光损伤。这允许研究各种皮质区域中特定细胞的分子和细胞动力学。

多光子显微镜已用于小鼠神经元和神经胶质细胞的体内成像^{15，16，17，18，19，20}。可以实施各种策略来标记特定的细胞类型和感兴趣的区域。一种常见的方法是使用Cre-Lox重组系统以细胞特异性方式驱动遗传编码荧光蛋白的表达。这可以用转基因小鼠进行，例如，将tdTomato“floxed”小鼠（Ai14）与在感兴趣的启动子²¹下表达Cre-重组酶的小鼠杂交。或者，可以通过病毒注射实现细胞和位点特异性标记。在这里，在细胞特异性启动子下编码Cre重组酶的病毒和编码絮状目的基因的病毒被注射到定义的区域中。然后，接受两种病毒载体的适当细胞类型将表达所需的基因。这些基因可以是结构标记，如tdTomato，以查看细胞形态变化²²或遗传编码钙指示剂（GECI），如GCaMP和/或RCaMP，以检查钙动力学²³。遗传重组的方法可以单独或组合地用于标记一种或多种细胞类型。第三种方法，不需要转基因小鼠或病毒构建体（其具有有限的包装能力），是在²⁴的DNA构建体的子宫电穿孔中。根据电穿孔的时间，可以靶向不同的细胞类型^25，26，27。

当进行多光子成像时，可以在清醒或麻醉时对小鼠进行成像。清醒小鼠的成像可以通过通过连接的头板²⁸固定小鼠来进行。这种方法通过允许动物相对自由地移动来减轻压力，例如自由漂浮，空气支撑的聚苯乙烯泡沫塑料球²⁹，自由漂浮的跑步机¹，或空气提升的家庭笼子系统，其中小鼠被连接的头板固定并允许在开放的腔室³⁰中移动。对于这些成像条件中的每一种，首先需要使小鼠习惯于成像设置。本文描述了使用空气提升家庭笼系统的习惯化和成像过程。

该协议描述了在皮层中植入用于纵向 体内 成像的慢性颅窗。在这里，我们将使用在星形胶质细胞中有条件表达GCaMP6f的小鼠来监测钙信号传导动力学。此外，本文描述了使用tdTomato作为神经元标签的病毒注射程序。这允许确定神经元突触结构的变化和/或作为结构标志物的可用性，从而实现对同一星形胶质细胞的重复成像。在整个实验方案中，将突出显示关键步骤，以确保从多光子显微镜获得的最佳图像质量。