使用多参数光伏平台对钙流入和HIV-1感染进行单细胞特征描述
Summary
在这里，我们提出了一个协议，其中单个细胞被监测急性事件和生产性HIV-1感染的纳米流体设备。成像数据定义病毒-宿主受体相互作用和信号通路动力学。这是研究信号动力学和分子相互作用的纳米流体高通量纵向单细胞培养和成像的第一种方法。
Abstract
艾滋病毒-1导致慢性感染，影响全世界3 700多万人。尽管进行了抗逆转录病毒治疗，但患有人类免疫缺陷病毒（HIV）的人会经历与慢性炎症有关的合并。然而，这些炎症信号并没有完全定性。早期进入事件对细胞信号事件和下游基因表达的激活作用尚未在单细胞水平上被捕捉到。在这里，作者描述了一种将活细胞荧光显微镜原理应用于自动化单细胞平台的方法，该平台通过用户定制的时间过程培养和成像细胞，从而能够对动态细胞过程进行高通量分析。这种检测可以跟踪HIV-1感染后立即发生的早期事件的单细胞活荧光显微镜，特别是接触病毒后钙的流入以及使用荧光记者病毒发展出的生产性感染。MT-4细胞装有钙敏感染料，在纳米流体装置上用分离的笔培养。培养的细胞感染了HIV-1报告病毒（HIV-1 NLCI）。放置在纳米流体装置上方的荧光显微镜测量急性HIV-1暴露后8分钟时间内的钙流入量。HIV-1生产性感染在4天间隔内在这些细胞中测量。分析这些时间课程的成像数据，以定义病毒-宿主受体相互作用和信号通路动力学。作者使用一种能够单细胞分拣、培养、成像和软件自动化的新型光伏平台，提出了一种集成的可扩展传统成像方法的替代方案。此检测可以测量各种条件下事件的动力学，包括细胞类型、激动剂或拮抗作用，同时测量一系列参数。这是第一个建立的纳米流体高通量纵向单细胞培养和成像方法：该技术可广泛应用于细胞信号动力学和动态分子相互作用的研究。
Introduction
慢性炎症是导致HIV相关早期发病率和死亡率的主要原因1，2，3。HIV可以激活炎症信号的多种机制，最近的证据表明P2X受体在HIV进入中的作用，即钙凝胶腺苷三磷酸盐（ATP）受体3、4、5、6、7、8、9、10。纯能受体的P2X亚型（P2XR）可能是这种炎症的重要促进剂。然而，艾滋病毒-P2XR相互作用的分子机制在很大程度上是未知的，并可能影响早期和后期艾滋病毒-1病毒的生命周期步骤。确定驱动艾滋病毒相关慢性炎症的途径和动力学对于推进艾滋病毒感染者的治疗方案至关重要。
为了评估HIV-1是否直接使P2X受体感到痛苦，必须同时测量P2XR活化和HIV-1感染。P2XR活性和HIV-1感染的检测已经独立确定：细胞钙的流入是P2XR活化的指标，HIV-1生产性感染可以通过RNA丰度进行量化。氟化物检测钙的流入是可能的与氟-4钙敏感染料，和HIV-1感染可以与MCherry荧光记者病毒HIV-NLCI 11，12，13，14，15可视化。
由于P2X活化（急性细胞钙流入）和HIV-1感染（HIV-1 RNA合成）的这些指标发生在不同的时间尺度（分钟与天数），因此缺乏一种高通量方法，可以对P2XR活化和HIV-1感染进行配对分析。标准的高通量实验技术，如流动细胞测量，允许对种群进行分析，但无法评估单个细胞中急性和纵向事件之间的关系。或者，具有标准荧光显微镜的单细胞成像是低通量的。这些实验限制要求采用新型的高通量技术直接测量急性和纵向细胞事件之间的关联。
描述的光伏系统是一个新型的平台，能够单细胞分拣和隔离，培养，成像和软件自动化16，17，18，19。该系统是传统成像方法的局限性之外，具有集成的高通量替代方法。信标平台由二氧化碳（CO2）和温度控制的孵化器组成，支持芯片上所含的细胞。该芯片具有感光晶体管，可产生电梯度以响应目标光。由此产生的介电力用于将单个细胞穿过纳米流体芯片移动到所需的区域。细胞被分拣成芯片上的笔，这为物理上分离单个细胞提供了障碍。整个芯片中生长介质的连续层压流可防止从笔中移动细胞，同时允许小颗粒传播营养物质和实验特异性试剂。荧光显微镜位于芯片上方。软件自动化用于在用户指定的时间点捕获芯片的图像。
所有细胞特征都是使用光伏系统进行单细胞选择和操作的。该系统由集成机械、微流体和光学元件组成，可实现单细胞操作、检测、培养和成像。细胞在一次性纳米流体装置上加载和培养，由 3，500 个单独的腔室（笔）组成，每个腔室都能够容纳亚纳米音量。细胞可以使用光诱导的介电”笼子”定位在笔内，并在温度和二氧化碳控制条件下培养。微流体允许在芯片上灌注介质或缓冲液用于细胞培养或药物治疗。一个激活的针头允许从孵化和关闭的井板细胞的进出口。芯片区域可在明亮场和荧光通道（包括 DAPI、FITC、TRed 或 Cy5）中以 4 倍或 10 倍的放大倍数进行成像，以描述蜂窝表型或功能分析。整个系统使用可用于预先设计的工作流或自定义实验的软件实现自动化。
已研究艾滋病毒-1感染与P2XR之间的关系，但尚未报告直接描述这些相互作用的高通量程序。在这里，作者描述了一种通过跟踪急性钙流入和随后的HIV-1单细胞水平生产性感染来研究HIV-P2XR相互作用的方法。值得注意的是，这建立了一个新颖的工具，允许直接，高通量，纵向测量多个目标在单个细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
研究单细胞中钙流入与HIV-1生产性感染之间关系的描述方法可以应用于研究细胞内钙动力学，以应对其他感兴趣的拮抗剂或拮抗剂。成像细胞的制备简单、时间最短，并且试剂可从广泛使用的制造商的方便套件中获得。氟-4基钙测量在文献中得到了很好的描述，在这个平台上研究HIV-1很容易被其他病毒或感兴趣的化合物所取代。可以使用不同的细胞类型和文化介质。支持替代或附加荧光通道，并可?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢与陈本雅明博士的科学讨论。这项工作由 K08AI120806 （THS）、R01DA052255 （THS 和 KB） 和 R21AI152833 （THS 和 KB） 资助。
Materials
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 | |
Referências
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