Caractérisation unicellulaire de l’afflux de calcium et de l’infection par le VIH-1 à l’aide d’une plateforme optofluidique multiparamètres

L’inflammation chronique est l’une des principales causes de morbidité précoce et de mortalité associées au VIH^1,2,3. Il existe de multiples mécanismes par lesquels le VIH peut activer la signalisation inflammatoire, et des preuves récentes suggèrent un rôle pour les récepteurs P2X dans l’entrée du VIH qui sont des récepteurs d’adénosine triphosphate (ATP)^{3,4,5,6,7,8,9,10.} Le sous-type P2X des récepteurs purinergiques (P2XR) peut être des facilitateurs importants de cette inflammation. Cependant, les mécanismes moléculaires des interactions VIH-P2XR sont largement inconnus et peuvent avoir une incidence sur les étapes précoces et tardives du cycle de vie viral du VIH-1. Il est essentiel de définir les voies et la cinétique à l’origine de l’inflammation chronique associée au VIH pour faire progresser les options de traitement pour les personnes vivant avec le VIH.

Pour évaluer si le VIH-1 angoisse directement les récepteurs P2X, l’activation du P2XR et l’infection par le VIH-1 doivent être mesurées en parallèle. Des tests d’activité P2XR et d’infection par le VIH-1 ont été établis indépendamment : l’afflux cellulaire de calcium est un indicateur de l’activation du P2XR, et l’infection productive par le VIH-1 peut être quantifiée par l’abondance de l’ARN. La détection de fluorescence de l’afflux de calcium est possible avec le colorant sensible au calcium Fluo-4, et l’infection par le VIH-1 peut être visualisée avec le virus rapporteur fluorescent mCherry HIV-NLCI^{11,12,13,14,15.}

Étant donné que ces indicateurs d’activation du P2X (afflux cellulaire aigu de calcium) et d’infection par le VIH-1 (synthèse de l’ARN du VIH-1) se produisent sur différentes échelles de temps (minutes par rapport aux jours), il manque une méthode à haut débit qui permet une analyse appariée de l’activation du P2XR et de l’infection par le VIH-1. Les techniques expérimentales standard à haut débit, telles que la cytométrie en flux, permettent l’analyse de la population, mais ne peuvent pas évaluer la relation entre les événements aigus et longitudinaux dans les cellules individuelles. Alternativement, l’imagerie unicellulaire avec microscopie à fluorescence standard est à faible débit. Ces limites expérimentales présentent un besoin de nouvelles techniques à haut débit pour mesurer directement les associations entre les événements cellulaires aigus et longitudinaux.

Un système optofluidique décrit est une nouvelle plate-forme capable de tri et d’isolation unicellulaires, de culture, d’imagerie et d’automatisation logicielle^16,17,18,19. Ce système présente une alternative intégrée et à haut débit aux limites des méthodes d’imagerie traditionnelles. La plate-forme Beacon se compose d’un incubateur de dioxyde de carbone (CO₂₎et à température contrôlée qui prend en charge les cellules contenues dans une puce. La puce possède des transistors photosensibles qui génèrent un gradient électrique en réponse à la lumière ciblée. Cette force dielectrophorétique résultante est utilisée pour déplacer des cellules individuelles à travers la puce nanofluidique vers les régions souhaitées. Les cellules sont triées dans des stylos sur la puce, qui constituent une barrière pour isoler physiquement les cellules individuelles. Le flux laminaire continu des milieux de croissance à travers la puce empêche la migration cellulaire des stylos tout en permettant la diffusion de petites particules de nutriments et de réactifs spécifiques à l’expérience. Un microscope à fluorescence se trouve au-dessus de la puce. L’automatisation logicielle est utilisée pour capturer des images de la puce au point de temps spécifié par l’utilisateur.

Toute la caractérisation de cellules a été exécutée utilisant un système optofluidic pour la sélection et la manipulation de simple-cellule. Ce système se compose de composants mécaniques, microfluidiques et optiques intégrés qui permettent la manipulation, le dosage, la culture et l’imagerie unicellulaires. Les cellules sont chargées et cultivées sur le dispositif nanofluidique jetable composé de 3 500 chambres individuelles (stylos), chacune capable de contenir un volume sub-nanolittre. Les cellules peuvent être positionnées dans des enclos à l’aide de « cages » dielectrophorétiques induites par la lumière et cultivées dans des conditions contrôlées par la température et le CO_2. La microfluidique permet la perfusion de milieux ou de tampons sur la puce pour la culture cellulaire ou le traitement médicamenteux. Une aiguille actionnée permet l’importation et l’exportation de cellules à partir de plaques de puits incubées et obturées. La zone de la puce peut être iluminée à un grossissement 4x ou 10x dans des canaux lumineux et fluorescents (y compris DAPI, FITC, TRed ou Cy5) pour caractériser les phénotypes cellulaires ou l’analyse fonctionnelle. L’ensemble du système est automatisé à l’aide d’un logiciel qui peut être utilisé pour des flux de travail prédéfinis ou des expériences personnalisées.

Des relations entre l’infection par le VIH-1 et le P2XR ont été étudiées, mais aucune procédure à haut débit n’a été signalée pour caractériser directement ces interactions en parallèle. Ici, les auteurs décrivent une méthodologie pour étudier les interactions VIH-P2XR en suivant l’afflux aigu de calcium et l’infection productive subséquente au VIH-1 au niveau unicellulaire. Il s’agit notamment d’un nouvel outil qui permet une mesure longitudinale directe et à haut débit de plusieurs cibles dans des cellules individuelles.